董姍姍，章嫡妮，于賜剛，王長永，劉燕

生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，環(huán)境保護(hù)生物安全重點(diǎn)實驗室，南京 210042

以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)為保障糧食安全、推動農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的途徑。2019年，全球4種主要轉(zhuǎn)基因作物——棉花、大豆、玉米和油菜的平均應(yīng)用率為52.8%，其中轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米的應(yīng)用率分別為74%和31%[1]。轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模商業(yè)化種植的潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險已引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全評價仍主要集中在陸地生態(tài)系統(tǒng)，對水生生態(tài)系統(tǒng)的研究相對匱乏。

轉(zhuǎn)基因作物中的外源蛋白可通過植物殘體、花粉和根際分泌物等途徑進(jìn)入農(nóng)田土壤和水體，并隨地表徑流和地表徑流沉積物進(jìn)入鄰近水域。已有研究顯示，轉(zhuǎn)Bt玉米田間的地表水和沉積物中Cry1Ab蛋白濃度可分別達(dá)130 ng·L-1和143 ng·L-1[2-4]，玉米田附近河流中淡水河蚌的腮、性腺和消化腺等組織內(nèi)均能檢測到cry1Ab基因的存在[5]。轉(zhuǎn)基因蛋白在水體中的存續(xù)和累積可能對水生生物的安全構(gòu)成潛在風(fēng)險。此外，轉(zhuǎn)基因作物的凋落物和殘體可以為水生動物直接或間接地提供食物，是其鄰近水域內(nèi)生物群落重要的能量和營養(yǎng)來源，長期大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因作物可能會誘發(fā)影響水生動物群落結(jié)構(gòu)、種群數(shù)量以及攝食行為等諸多因子的變化[6]。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要生物組成之一，通過檢測魚類生理和行為反應(yīng)可以有效監(jiān)測水環(huán)境質(zhì)量的變化[7]。近年來，已有研究以魚類為模式動物評價轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)毒理效應(yīng)，大多數(shù)研究是通過開展轉(zhuǎn)基因作物的飼喂實驗，調(diào)查魚類的生長表現(xiàn)、組織病理、臟器發(fā)育、運(yùn)動行為、應(yīng)激和免疫反應(yīng)以及繁殖能力等，評估轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及其表達(dá)蛋白對魚類的安全性[8-9]。在調(diào)查魚類的各項指標(biāo)時，通常是在飼喂實驗結(jié)束時，集中采集樣本進(jìn)行檢測分析，沒有對喂養(yǎng)期間魚類的生長、發(fā)育、病理以及生理等方面的變化進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，這可能會影響最終的結(jié)果判定。而且，在魚類的不同生長發(fā)育時期，其攝取轉(zhuǎn)基因飼料后的反應(yīng)可能會不同[10-11]。對喂養(yǎng)期間魚類的生長發(fā)育、生理等指標(biāo)進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，更有利于全面評估轉(zhuǎn)基因作物的潛在生態(tài)毒性或非預(yù)期效應(yīng)。

斑馬魚(Daniorerio)基因組與人類基因組具有較高同源性，是發(fā)育生物學(xué)、毒理學(xué)、基因功能以及人類代謝疾病研究中的理想模型[12-13]。由于斑馬魚體型小、世代周期短、易于飼養(yǎng)和繁殖，近些年也被推薦作為轉(zhuǎn)基因作物安全性評價中的模式動物[14-15]。本研究以斑馬魚為受試動物，以我國自主研制的轉(zhuǎn)Cry1Ie基因玉米IE09S034和轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆中作J9331為原料分別配制飼料，檢測轉(zhuǎn)基因飼料的營養(yǎng)成分和霉菌毒素含量，通過98 d的喂養(yǎng)實驗，調(diào)查斑馬魚的攝食、生長、抗氧化酶活性和繁殖等指標(biāo)，分析不同喂養(yǎng)階段斑馬魚的組織病理及敏感蛋白mRNA表達(dá)水平，探討轉(zhuǎn)基因作物對魚類的生態(tài)毒理效應(yīng)，為轉(zhuǎn)基因作物對水生動物的環(huán)境安全評價提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

供試的玉米材料為轉(zhuǎn)Cry1Ie基因抗蟲玉米IE09S034及其非轉(zhuǎn)基因近等基因系綜31，供試的大豆材料為轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因耐除草劑大豆中作J9331及其非轉(zhuǎn)基因近等基因系中黃30，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

受試動物為野生型AB品系斑馬魚，由中國科學(xué)院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心購買的種魚所繁殖。幼魚開口期的餌料為草履蟲(Parameciumcaudatum)，孵化出20 d后喂食豐年蟲(Artemiasalina)，每天早、中、晚喂食3次。幼魚在靜水中飼養(yǎng)30 d左右，轉(zhuǎn)移至斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(Aquatic habitats ZF0601, Apopka, FL, USA)中養(yǎng)殖，該系統(tǒng)為循環(huán)水，每天換水量為10%。魚齡達(dá)到60 d時開始喂食商業(yè)顆粒飼料，每天喂食量為其體質(zhì)量(濕質(zhì)量)的4%。斑馬魚魚齡達(dá)到90 d時開始試驗，測量受試魚初始體質(zhì)量和體長。

1.2 試驗飼料的制備及檢測

試驗飼料制備前，對所有玉米和大豆材料的主要營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測，為后續(xù)飼料配制提供參考。根據(jù)美國國家研究委員會(National Research Council, NRC)制定的魚類營養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)配制人工飼料[16]，飼料配方如表1所示。飼料加工前，將玉米和大豆種子用商用磨粉機(jī)(FLBP-250，上海菲力博)打磨成粉，過100目篩網(wǎng)備用，加工時先將明膠和加麗素紅溶于80 ℃左右的純凈水中，攪拌均勻，然后按照比例“由小到大”的順序依次填加表1中的其他飼料成分，添加過程中用攪拌機(jī)不斷攪拌使其充分混合，混合均勻的飼料用家用料理機(jī)制作成直徑1.5 mm的條狀，平鋪于托盤上，置于陰涼處自然風(fēng)干，再根據(jù)斑馬魚口徑大小進(jìn)行研磨和過篩，使飼料顆粒直徑為450～550 μm，4 ℃冷藏。商業(yè)顆粒飼料為購買自日清丸紅(天津)飼料科技有限公司的熱帶魚飼料，主要成分為魚粉、豆粕、小麥淀粉、魚肝油、復(fù)合維生素及礦物質(zhì)等。通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的Cry1IE蛋白，ELISA試驗的單克隆抗體和檢測方法均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所劉允軍博士提供。采用CP4-EPSPS蛋白檢測試紙條(Agdia Elkhart, IN, USA)檢測耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆飼料中的CP4-EPSPS蛋白。同時，采用轉(zhuǎn)基因蛋白檢測試紙條(Agdia Elkhart, IN, USA)檢測了商業(yè)飼料中的Cry1Ab/Ac及CP4-EPSPS外源蛋白。對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米飼料中伏馬毒素B1(FB1)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEB)和嘔吐毒素(DON)的含量也進(jìn)行了檢測(英格爾檢測技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司)。

1.3 試驗設(shè)計

選擇體質(zhì)量和體長相近的斑馬魚隨機(jī)分成5組，即轉(zhuǎn)基因玉米組(GMM)、非轉(zhuǎn)基因玉米組(Non-GMM)、轉(zhuǎn)基因大豆組(GMS)、非轉(zhuǎn)基因大豆組(Non-GMS)和商業(yè)飼料對照組(CF)，每組設(shè)置3個平行(3缸)，每缸50條斑馬魚(10 L)。試驗期間的飼養(yǎng)條件與幼魚期飼養(yǎng)條件保持一致，試驗周期為98 d。每天喂食量為受試魚初始體質(zhì)量的3%～4%，分3次投喂(8:30、12:30、16:30)，并根據(jù)受試魚體質(zhì)量的變化調(diào)整喂食量。試驗期間每天對斑馬魚的游動、集群、棲息水層、食性及外觀的狀況進(jìn)行觀察，并記錄身體異常(如呼吸急促、不協(xié)調(diào)的游動和反常的靜止)和死亡情況等。試驗期間斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的水溫為(27.2±0.5) ℃、pH為7.2±0.4、電導(dǎo)率為(507±18) μS·cm-1，溶解氧為(10.2±1.1) mg·L-1，符合斑馬魚生長條件。

表1 試驗飼料配方成分和比例(%)Table 1 Composition and proportion (%) of the experimental feeds

1.4 生長指標(biāo)的測定

在試驗開始后的第14、28、42、56、70、84和98天，每缸隨機(jī)選取10條斑馬魚稱量(濕質(zhì)量)、測量體長，并根據(jù)測得的數(shù)據(jù)計算特定增長率和飼料轉(zhuǎn)化率。

1.5 組織病理學(xué)分析

在試驗開始后的第28、56和98天，將斑馬魚禁食12 h后，每缸隨機(jī)選取4條固定于10%的福爾馬林溶液中，脫水處理后將整條魚橫切成頭、胸腹、臀和尾4段，然后用石蠟包埋機(jī)(HistoStar, Thermo Fisher Scientific, USA)進(jìn)行組織蠟塊包埋，再利用全自動石蠟切片機(jī)(Shandon Finesse, Thermo Fisher Scientific, USA)切為4 μm左右的連續(xù)切片，采用蘇木精-伊紅(HE)將石蠟切片染色，最后在熒光顯微鏡(DX45, Olympus, Japan)下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)檢查結(jié)果，按照病變由輕到重的程度進(jìn)行打分，分別標(biāo)記為1、2、3和4分，無明顯病變?yōu)?分，極輕度病變?yōu)?.5分。

1.6 繁殖指標(biāo)檢測

每缸隨機(jī)選取5對斑馬魚按照雌雄比1∶2進(jìn)行配對產(chǎn)卵，從試驗的第70天開始至喂養(yǎng)結(jié)束，每14 d配對一次，總共配3次，記錄每對斑馬魚的產(chǎn)卵量、孵化率、孵化出仔魚的畸形和異常行為等。

1.7 肝臟和腸道超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性測定

在試驗開始后的第98天，每缸隨機(jī)選取雌性和雄性斑馬魚各2條，大體解剖后取其肝臟和腸道組織樣本，分別采用SOD試劑盒(Sigma, USA)和CAT試劑盒(Biovision, USA)檢測雌、雄魚肝臟和腸道組織中的SOD和CAT活性。

1.8 斑馬魚臟器組織中SOD、CAT和熱激蛋白70(HSP70) mRNA表達(dá)量檢測

在試驗開始后的第28、56和98天，每缸隨機(jī)選取雌性和雄性斑馬魚各3條，大體解剖后取其肝臟、腸道和性腺組織樣本，采用微量RNA提取試劑盒(Qiagen, Germany)提取臟器組織的總RNA。通過超微量分光光度計(DS-11, DeNovix, USA)和瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的純度和完整性。RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用實時熒光定量PCR檢測斑馬魚肝臟、腸道和性腺組織中SOD、CAT和HSP70的mRNA表達(dá)水平，以actin為內(nèi)參基因，采用相對定量法2-ΔΔCT計算SOD、CAT和HSP70的mRNA表達(dá)量，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)試驗組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組，各基因的特異性引物序列和檢測方法均參照董姍姍等[17]的方法。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)斑馬魚體質(zhì)量和攝食量計算特定生長率(special growth rate, SGR)和飼料轉(zhuǎn)化率(feed conversion ratio, FCR)，特定生長率和飼料轉(zhuǎn)化率計算公式如下：

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100

FCR=C/(Wt-W0)

式中：Wt和W0分別為試驗結(jié)束時和試驗開始時的魚體濕質(zhì)量(mg)；t為試驗時間(d)；C為攝食量(mg)。

采用多因素方差分析(multi-way ANOVA)分別檢驗玉米組(包括轉(zhuǎn)基因玉米組、非轉(zhuǎn)基因玉米組和商業(yè)飼料對照組)和大豆組(包括轉(zhuǎn)基因大豆組、非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料對照組)中組別、性別、取樣時間以及它們之間的交互作用對不同臟器組織中敏感蛋白mRNA表達(dá)量和抗氧化酶活性的影響。單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗不同組別斑馬魚的體質(zhì)量、體長、特定生長率、飼料轉(zhuǎn)化率、組織病理以及繁殖等指標(biāo)的差異，顯著性水平設(shè)為α=0.05，若檢驗結(jié)果顯著，則采用Tukey法進(jìn)行不同組別間的多重比較。利用獨(dú)立樣本T檢驗(T-test)比較雌性和雄性斑馬魚臟器組織中敏感蛋白mRNA表達(dá)量及抗氧化酶活性的差異(α=0.05)。以上分析均使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件完成。試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 試驗飼料的營養(yǎng)成分、霉菌毒素含量以及外源基因表達(dá)蛋白

飼料營養(yǎng)成分的分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因飼料與相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因飼料在主要營養(yǎng)成分上沒有明顯差異，且都能夠滿足斑馬魚的生長需求(表2)，但與商業(yè)飼料相比，人工飼料中的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量明顯偏低，而淀粉含量明顯偏高。對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米飼料中霉菌毒素的檢測結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的FB1、DON和AFB1含量略高于轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的，不過兩者均遠(yuǎn)低于《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)中規(guī)定的最高限量水平(表2)[18]。在轉(zhuǎn)基因玉米飼料和轉(zhuǎn)基因大豆飼料中均檢測到了外源基因表達(dá)蛋白，而相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因飼料和商業(yè)飼料中Cry1Ac和CP4-EPSPS蛋白呈陰性(表2)。

2.2 生長表現(xiàn)

受試斑馬魚的初始平均體質(zhì)量和體長分別為(124.78±4.69) mg和(23.0±0.3) mm，在試驗期間各組斑馬魚的體質(zhì)量和體長均呈明顯增加趨勢。轉(zhuǎn)基因組與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因組斑馬魚的各項生長指標(biāo)整體上無顯著差異(圖1)，但在試驗98 d時，轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚體質(zhì)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因玉米組的(P<0.05)，與商業(yè)飼料組相比，人工飼料組斑馬魚的體長、體質(zhì)量和特定生長率均顯著偏低，飼料轉(zhuǎn)化率顯著偏高(圖1)。

2.3 組織病理

斑馬魚肝臟、腸道和腦組織的病理檢測結(jié)果整體上為無明顯病變、極輕度或輕度病變。肝臟病變主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂變，多數(shù)為輕度，少數(shù)為中度，個別重度。少數(shù)斑馬魚腸壁黏膜上皮中的杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，提示腸道黏液分泌增加。各組斑馬魚腦組織神經(jīng)細(xì)胞和白質(zhì)未見明顯病變，只在試驗28 d時非轉(zhuǎn)基因玉米組有1條受試魚的個別神經(jīng)細(xì)胞壞死。對組織病理評分的方差分析結(jié)果顯示，在試驗56 d時，商業(yè)飼料組斑馬魚腸道病變程度顯著高于轉(zhuǎn)基因大豆組(P<0.05)(表3)，其他取樣時間點(diǎn)各組間斑馬魚肝臟、腸道和腦組織病變程度無顯著差異。隨著試驗時間推移，各組肝臟病變(肝細(xì)胞脂變)程度有加重趨勢(表3)。

2.4 繁殖指標(biāo)

斑馬魚配對產(chǎn)卵結(jié)果顯示，在每組隨機(jī)選取的45對斑馬魚中，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米組有75%左右的雌魚產(chǎn)卵，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆組有68%左右的雌魚產(chǎn)卵，商業(yè)飼料組有84%產(chǎn)卵，轉(zhuǎn)基因飼料組與非轉(zhuǎn)基因飼料組的平均產(chǎn)卵量和受精卵孵化率均無顯著差異(圖2)，不過試驗飼料組的產(chǎn)卵量和孵化率與商業(yè)飼料組相比整體偏低(135±15vs175±23，(53.1±4.5)%vs(60.8±2.3)%)，各組孵化出的幼魚均未見身體畸形和明顯異常行為。

2.5 肝臟和腸道中抗氧化酶活性

玉米組多因素方差分析結(jié)果顯示(表4)，組別和性別對斑馬魚腸道中的SOD酶活有顯著影響，非轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚SOD酶活顯著高于商業(yè)飼料組的，商業(yè)飼料組雌魚SOD酶活相對于雄魚顯著偏低。性別以及性別與組別的交互作用對玉米組斑馬魚腸道中的CAT酶活有顯著影響，即在不同組別中，雌魚和雄魚的表現(xiàn)不一致，T檢驗發(fā)現(xiàn)僅在轉(zhuǎn)基因玉米組中雌魚腸道中的CAT酶活顯著高于雄魚(圖3)。大豆組多因素方差分析結(jié)果顯示(表4)，組別和性別對斑馬魚肝臟中的SOD酶活有顯著影響，轉(zhuǎn)基因大豆組顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料組，雄魚的SOD酶活顯著高于雌魚。

表2 飼料的營養(yǎng)成分、外源蛋白和霉菌毒素含量Table 2 Nutrient composition, exogenous protein and the content of mycotoxins of the diets

圖1 不同組別斑馬魚的體長、體質(zhì)量、特定生長率和飼料轉(zhuǎn)化率注：不同大寫字母表示轉(zhuǎn)基因玉米組、非轉(zhuǎn)基因玉米組和商業(yè)飼料組之間在P<0.05水平上差異顯著； 不同小寫字母表示轉(zhuǎn)基因大豆組、非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料組之間在P<0.05水平上差異顯著；下同。Fig. 1 Length, weight, specific growth rate and feed conversion ratio of zebrafish in different groupsNote: Different capital letters represent significant difference between GMM, Non-GMM and CF at P<0.05; different lowercase letters represent significant difference between GMS, Non-GMS and CF at P<0.05; the same below.

表3 不同組別斑馬魚肝臟、腸道和腦組織病理學(xué)檢測結(jié)果Table 3 Histopathological results of liver, intestinal tract and brain of zebrafish in different groups

圖2 不同組別斑馬魚的產(chǎn)卵量和受精卵孵化率Fig. 2 The egg-laying amount and hatching rates of fertilized eggs of zebrafish in different groups

圖3 不同組別斑馬魚肝臟和腸道中超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性注：(a)和(b)為肝臟，(c)和(d)為腸道；*和**分別表示同組雌魚與雄魚間在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。Fig. 3 Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity in the liver and intestinal tract of zebrafish in different groupsNote: (a) and (b) are liver, (c) and (d) are intestinal tract; *and **represent significant difference between female and male zebrafish at P<0.05 and P<0.01, respectively.

2.6 不同臟器組織中SOD、CAT和HSP70的mRNA表達(dá)量

對玉米組斑馬魚肝臟、腸道和性腺組織中，敏感蛋白mRNA表達(dá)量的多因素方差分析結(jié)果顯示(表5)，試驗持續(xù)時間與組別和性別的交互作用對臟器組織中SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)量有顯著影響，說明在不同取樣時間點(diǎn)、不同組別和性別間差異的表現(xiàn)不同。例如：在試驗28 d時，轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚肝臟中CATmRNA表達(dá)量顯著高于商業(yè)飼料組，但在98 d時，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米組CATmRNA表達(dá)量均顯著低于商業(yè)飼料組；在28 d時，雌魚肝臟中的HSP70 mRNA表達(dá)水平與雄魚相比顯著偏高，到98 d時顯著偏低(表6)。大豆組的多因素方差分析結(jié)果顯示(表5)，組別對斑馬魚肝臟和腸道中的SOD和CATmRNA表達(dá)量有顯著影響，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆組的SOD和CATmRNA表達(dá)量均顯著低于商業(yè)飼料組(表7)，試驗時間與組別和性別的交互作用顯著影響性腺組織中SOD和CATmRNA的表達(dá)水平，各組之間的差異在不同取樣時間點(diǎn)沒有一致的表現(xiàn)。通過對玉米組和大豆組中不同處理組間的多重比較，發(fā)現(xiàn)組別之間的差異主要來自人工飼料組與商業(yè)飼料組之間，而不是轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因飼料組之間(表8)。而且隨著試驗時間的推移，斑馬魚臟器組織中的敏感蛋白mRNA表達(dá)水平并沒有表現(xiàn)出明顯升高或下降的趨勢。

表4 組別和性別對斑馬魚肝臟和腸道中抗氧化酶活性影響的多因素方差分析Table 4 Multi-way ANOVA of the effects of group and sex on the antioxidant enzymes activities in liver and intestinal tract of zebrafish

表5 組別、性別和試驗時間對斑馬魚臟器組織中敏感蛋白mRNA表達(dá)水平影響的多因素方差分析Table 5 Multi-way ANOVA of the effects of group, sex and experimental duration on mRNA expression levels in tissues of zebrafish

3 討論(Discussion)

3.1 轉(zhuǎn)基因作物對斑馬魚生長表現(xiàn)的影響

抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對斑馬魚的體質(zhì)量、體長、飼料轉(zhuǎn)化率和特定生長率整體上沒有顯著影響，但在試驗98 d時，轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚的體質(zhì)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M。生長指標(biāo)的變化通常被認(rèn)為是生物體中各種生物因素綜合變化的結(jié)果，并且可能作為評估魚類生態(tài)毒性效應(yīng)的終點(diǎn)指標(biāo)[19]。一般情況下，生長指標(biāo)的降低會伴隨著飼料攝取量和轉(zhuǎn)化率的下降，本研究未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚的飼料轉(zhuǎn)化率有顯著差異，而且整個試驗期間僅在最后一次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米組的體質(zhì)量顯著偏低，這種差異可能是測量中的隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致，沒有生物學(xué)意義。在用含有抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米(MON810)的飼料喂食大西洋鮭的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米組的最終體質(zhì)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因玉米組，推測可能是由于飼料中某些成分的差異，比如：直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例或纖維素含量的差異等，可能會影響魚類的消化率進(jìn)而引起生長指標(biāo)的變化[10]。

值得注意的是，與4個試驗飼料組相比，商業(yè)飼料組斑馬魚的生長表現(xiàn)更好，之前在以商業(yè)飼料作為對照的研究中也有類似結(jié)果[17,20]。盡管我們配制的試驗飼料能夠滿足斑馬魚的營養(yǎng)需求，但在加工工藝上與商業(yè)飼料有較大差別。為了最大限度保證轉(zhuǎn)基因作物中的外源蛋白在飼料制備過程中不被降解，我們沒有對試驗飼料進(jìn)行加熱加壓處理，而商業(yè)飼料是經(jīng)高溫、高壓處理后的顆粒飼料，其適口性和消化率都優(yōu)于試驗飼料，這可能會直接影響斑馬魚的攝食量和飼料利用率。此外，商業(yè)飼料中粗蛋白和粗脂肪的含量相對較高，可能更利于營養(yǎng)成分的吸收和利用[21]，從而提高斑馬魚的特定增長率。

3.2 轉(zhuǎn)基因作物對斑馬魚組織病理的影響

98d的喂養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對斑馬魚肝臟、腸道和性腺的組織病理沒有顯著影響。但隨著試驗時間增加，各組斑馬魚肝細(xì)胞脂變程度表現(xiàn)出從無明顯病變至輕度病變的趨勢，推測與飼料中的脂肪和蛋白質(zhì)配比、霉菌毒素、抗?fàn)I養(yǎng)因子以及營養(yǎng)素(比如：膽堿、維生素)等因素有關(guān)，長期飼喂可能影響斑馬魚的脂肪代謝，導(dǎo)致肝臟脂肪沉積[22-23]。已有文獻(xiàn)報道，經(jīng)過7個月的長期喂養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因大豆組和非轉(zhuǎn)基因大豆組大西洋鮭腸道均出現(xiàn)輕微炎癥，推測可能是大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子誘發(fā)的炎癥[24]。在用含有抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的飼料連續(xù)喂食2代斑馬魚的研究中，轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組子一代斑馬魚都有個別樣本的腸道組織出現(xiàn)輕微炎癥[25]。

3.3 轉(zhuǎn)基因作物對斑馬魚繁殖的影響

抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對斑馬魚的繁殖性能無顯著影響，各組斑馬魚的平均產(chǎn)卵量為(144±17)粒，與文獻(xiàn)報道的相近[25]。但試驗飼料組的產(chǎn)卵量和受精卵孵化率，與商業(yè)飼料組相比均略偏低，可能主要由于試驗飼料與商業(yè)飼料在適口性和營養(yǎng)成分上的差異，影響斑馬魚的攝食、飼料轉(zhuǎn)化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收，在一定程度上對其性腺等生殖器官的發(fā)育產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致產(chǎn)卵量和孵化率偏低[26-27]。目前國際上在轉(zhuǎn)基因作物對魚類的飼用安全性研究中，涉及繁殖能力的還很少，主要因為大部分研究以大西洋鮭為受試動物，其性成熟時間較晚，仔魚孵化期長，對環(huán)境條件要求較高，試驗操作比較困難，而斑馬魚生育周期短、易于人工繁殖[9]。一項以斑馬魚為模式動物，調(diào)查轉(zhuǎn)Bt玉米對其繁殖能力影響的研究顯示，盡管轉(zhuǎn)基因玉米組親魚的產(chǎn)卵量略高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(P>0.05)，但2組胚胎的DNA甲基化水平和仔魚的行為活動均無顯著差異[25]。

3.4 轉(zhuǎn)基因作物對斑馬魚臟器組織中抗氧化酶活性和mRNA表達(dá)水平的影響

斑馬魚臟器組織中敏感蛋白mRNA的表達(dá)水平，沒有隨時間呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，各組間mRNA表達(dá)量的差異(92.6%)主要來自于試驗飼料組與商業(yè)飼料組之間，轉(zhuǎn)基因作物對其沒有顯著影響。這與Sagstad等[23]對大西洋鮭的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大豆組大西洋鮭臟器組織中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)量沒有顯著差異，但與魚粉飼料組相比，2組大西洋鮭腸道中的HSP70 mRNA表達(dá)水平均表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，推測可能與大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(如大豆凝集素)有關(guān)。已有文獻(xiàn)報道大豆凝集素能夠與大西洋鮭小腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，影響腸道的結(jié)構(gòu)和功能[28-29]。本研究中，性別與試驗時間的交互作用對斑馬魚臟器組織中的mRNA表達(dá)量有顯著影響，在不同取樣時間和不同檢測指標(biāo)上雌魚與雄魚的差異表現(xiàn)不同。Sissener等[20]對喂食轉(zhuǎn)基因大豆飼料的雌性和雄性斑馬魚檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆組雌魚肝臟中SOD的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于非轉(zhuǎn)基因大豆組，而雄魚在2組間沒有顯著差異。已有研究顯示，轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆中大豆異黃酮等植物雌激素的含量可能存在差異[30]，雌魚和雄魚對植物雌激素的敏感程度也有所差別[31]，植物雌激素能夠誘導(dǎo)雄魚肝臟中卵黃蛋白原的合成、影響魚的性腺發(fā)育和繁殖[32]。

表6 不同組別斑馬魚肝臟中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)水平Table 6 SOD, CAT and HSP70 mRNA expression levels in the liver of zebrafish in different groups

表7 不同組別斑馬魚腸道中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)水平Table 7 SOD, CAT and HSP70 mRNA expression levels in the intestinal tract of zebrafish in different groups

表8 不同組別斑馬魚性腺組織中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)水平Table 8 SOD, CAT and HSP70 mRNA expression levels in the gonad tissues of zebrafish in different groups

斑馬魚臟器組織中的抗氧化酶活性與其mRNA表達(dá)量之間沒有明顯的相關(guān)性，可能主要與基因表達(dá)過程中轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控有關(guān)。值得注意的是，玉米組雌魚和雄魚腸道中SOD酶活與其98 d時的mRNA表達(dá)量顯著相關(guān)，非轉(zhuǎn)基因玉米組的SOD酶活及其mRNA表達(dá)量均顯著高于商業(yè)飼料組，可能是飼料組成和營養(yǎng)成分上的差異導(dǎo)致。腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要器官，也是生物體免疫防御的重要屏障，腸道中抗氧化酶活性的變化可以指示脅迫條件下機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，非轉(zhuǎn)基因玉米飼料的FB1、DON和AFB1含量均略高于轉(zhuǎn)基因玉米飼料，已有文獻(xiàn)報道高劑量的霉菌毒素暴露可以誘導(dǎo)魚臟器組織中SOD基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[33-34]，DON和AFB1在魚體中的靶標(biāo)器官分別是腸道和肝臟[35]，因此，推測非轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚腸道中的SOD酶活和mRNA表達(dá)量顯著偏高，可能也與飼料中霉菌毒素含量相對偏高有關(guān)。

綜上所述，攝食含有抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆飼料的斑馬魚，在生長表現(xiàn)、組織病理和繁殖性能上與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比均無顯著差異。轉(zhuǎn)基因大豆組斑馬魚肝臟中的SOD酶活顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料組，且雄魚顯著高于雌魚(P<0.05)。斑馬魚臟器組織中敏感蛋白mRNA的表達(dá)水平，沒有隨時間呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，喂養(yǎng)時間與組別和性別之間存在顯著的交互作用?？傮w上看，轉(zhuǎn)Cry1Ie基因抗蟲玉米和轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因耐除草劑大豆對斑馬魚沒有明顯的生態(tài)毒性效應(yīng)。但是，試驗飼料組斑馬魚的生長表現(xiàn)、肝臟中SOD酶活以及mRNA表達(dá)量與商業(yè)飼料組相比有顯著差異，可能與飼料的適口性和營養(yǎng)成分上的差異有關(guān)。