黃 燕，徐麗波，袁 麗，戴余雯，劉銘佩，李待軍

（1. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000 ；2. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 ；3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

銀屑片是蘭州大學(xué)第二醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由梔子、黃芪等9 味中藥組成，具有瀉火除煩、清熱涼血等功效，主要用于牛皮癬的治療，臨床療效顯著[1]。微生物污染是影響制劑質(zhì)量和引發(fā)不良反應(yīng)的重要因素之一。為了保證制劑質(zhì)量，必須采用適宜的方法對其進(jìn)行微生物限度檢查[2]。在本文中，筆者主要是分析采用文中所選微生物限度檢查方法對銀屑片進(jìn)行微生物限度檢查的適用性。

1 材料與儀器

1.1 試驗樣品

銀屑片，100 片/ 瓶。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液。上述培養(yǎng)基均購自青島海博科技生物技術(shù)有限公司。

1.3 菌種

白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、乙型副傷寒沙門菌〔CMCC(B)50094〕、大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕、黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕、 枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕、銅綠假單胞菌〔CMCC(B)44104〕、金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕，以上菌種均購自中國食品藥品檢驗研究院。

1.4 儀器

蘇州安泰BSC-1304 ⅡA2 型生物安全柜、上海躍進(jìn)SPX-80B 型生化培養(yǎng)箱、麥克奧迪AE2000 型顯微鏡、上海三申YX280A 型壓力消毒器、梅特勒XSZ205 型電子天平。

2 微生物計數(shù)檢查方法適用性試驗

2.1 菌液制備

將各菌種均制成不同濃度的菌懸液。選用pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌分別制成濃度為104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 的菌懸液，選用0.9% 的無菌氯化鈉溶液將白色念珠菌、黑曲霉菌分別制成濃度為104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 的菌懸液[3]。

2.2 供試液制備

取銀屑片10 g，加pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液100 mL，制成1:10 供試液。取10 mL，加90 mL pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，制成1:100 供試液，備用。

2.3 微生物計數(shù)檢查

2.3.1 試驗組樣品的制備 1）平皿法樣品的制備：取7 份10 mL 的1:10 供試液，分別加0.1 mL 的“2.1”項下菌懸液（104 cfu/mL），搖勻，取樣1 mL，傾注相應(yīng)培養(yǎng)基。2）培養(yǎng)基稀釋法（1:10）樣品的制備：取7 份10 mL 的1:10 供試液，分別加0.1 mL 的“2.1”項下菌懸液（104 cfu/mL），分別取樣0.2 mL、0.5 mL，傾注相應(yīng)培養(yǎng)基。3）供試液稀釋法（1:100）樣品的制備：取5 份10 mL 的1:100 供試液，分別加0.1 mL 的“2.1”項下菌懸液（104 cfu/mL），取樣1 mL，傾注相應(yīng)培養(yǎng)基[4-5]。

2.3.2 菌液對照樣品的制備 取相應(yīng)量的“2.1”項下菌懸液（102cfu/mL）注皿，傾注相應(yīng)培養(yǎng)基。

2.3.3 供試液對照樣品的制備 取相應(yīng)量的“2.2”項下供試液注皿，其他操作同“2.3.1”。

2.3.4 陰性對照樣品的制備 取相應(yīng)量的pH 7.0無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液替代供試液，注皿，不加菌懸液，其他操作同“2.3.1”。

2.3.5 用不同微生物計數(shù)檢查方法對銀屑片進(jìn)行微生物計數(shù)檢查適用性的比較 平皿法樣品中銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的回收比值均低于0.5。這表明，此微生物計數(shù)檢查方法不適用于對銀屑片進(jìn)行需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查及霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查[6-7]。培養(yǎng)基稀釋法（1:10，0.2 mL/ 皿）樣品中白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值均高于0.5。這表明，此微生物計數(shù)檢查方法適用于對銀屑片進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查。供試液稀釋法（1:100，1 mL/ 皿）樣品中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌的回收比值均大于0.5。這表明，此微生物計數(shù)檢查方法適用于對銀屑片進(jìn)行需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查。詳見表1。

表1 用不同微生物計數(shù)檢查方法對銀屑片進(jìn)行微生物計數(shù)檢查適用性的比較

2.4 用上述微生物計數(shù)檢查方法對銀屑片進(jìn)行微生物計數(shù)檢查適用性的驗證

由表2 可知，采用供試液稀釋法（1:100，1 mL/皿）和培養(yǎng)基稀釋法（1:10，0.2 mL/ 皿）進(jìn)行銀屑片加菌回收試驗時各種需氧菌、霉菌和酵母菌的回收比值均在0.5 ～2.0 之間。這表明，采用上述微生物計數(shù)檢查方法對銀屑片進(jìn)行需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查及霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查的適用性良好。

表2 銀屑片加菌回收試驗的結(jié)果

3 控制菌檢查方法適用性試驗

3.1 試驗組樣品的制備

取銀屑片10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌菌懸液各1 mL（102cfu/mL），然后進(jìn)行培養(yǎng)、接種、觀察。

3.2 陽性對照樣品的制備

取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌菌懸液各1 mL（102cfu/mL），加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，其余操作同上。

3.3 供試液對照樣品的制備

取1:10 供試液10 mL，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，不加菌懸液，其余操作同上。

3.4 陰性對照樣品的制備

取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，其余操作同上。

3.5 控制菌檢查方法適用性驗證試驗的結(jié)果

由表3 可知，試驗組樣品和陽性對照樣品中正常檢出了大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭氏陰性菌和沙門菌，陰性對照樣品和供試液對照樣品中未檢出大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭氏陰性菌和沙門菌。這表明，采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基法（培養(yǎng)基稀釋體積為100 mL）對銀屑片進(jìn)行控制菌檢查的適用性良好。

表3 用上述控制菌檢查方法對銀屑片進(jìn)行控制菌檢查適用性驗證試驗的結(jié)果

4 討論

醫(yī)院制劑是臨床用藥不可或缺的一部分，長期以來，其因具有使用方便快捷、價格便宜、療效佳等優(yōu)點，在臨床治療服務(wù)中發(fā)揮著極其重要的作用。由于醫(yī)院制劑只能在醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)使用，生產(chǎn)規(guī)模較小、生產(chǎn)設(shè)備較簡單，導(dǎo)致制劑質(zhì)量出現(xiàn)問題的風(fēng)險較高[8-9]。進(jìn)行微生物限度檢查是控制制劑質(zhì)量的主要方法之一[10-11]。在為具有抑菌活性的中藥制劑選擇微生物限度檢查方法時，應(yīng)依據(jù)《中國藥典》中的相關(guān)要求進(jìn)行相應(yīng)的適用性試驗，以確保其自身抑菌活性不會造成檢查結(jié)果的偏差[12-14]。本研究的結(jié)果顯示，用文中所選微生物限度檢查方法對銀屑片進(jìn)行微生物限度檢查的適用性良好（即銀屑片自身的抑菌活性不會造成檢查結(jié)果的偏差）。綜上所述，文中所選微生物限度檢查方法可用于對銀屑片進(jìn)行微生物限度檢查。