林俏麗 李際強(qiáng) 白曉輝 陳麗琴 陳劍坤

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院綜合三科，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)院大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一種常見的慢性睡眠呼吸性疾病，患者入睡后常出現(xiàn)不明原因的上氣道阻塞，引起呼吸暫停和低通氣，導(dǎo)致間歇性低氧血癥、高碳酸血癥和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂等癥狀，并伴有白天嗜睡、心腦血管及多臟器損害等并發(fā)癥。成年人OSAHS患病率為4%～9%，中年女性發(fā)病率為1%～2%[1-5]。 經(jīng)研究證實(shí)，OSAHS患者低氧、缺氧將導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放入血，和炎癥因子、趨化因子共同引起機(jī)體多種病理生理變化[6-8]。此外，OSAHS的氧化應(yīng)激與自噬(Autophagy)之間存在密切聯(lián)系[9-11]。自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在，能夠降解細(xì)胞內(nèi)受損傷細(xì)胞器和長壽命蛋白質(zhì)的生理現(xiàn)象，為細(xì)胞在應(yīng)激條件下再次利用營養(yǎng)物質(zhì)，維持自身生存的關(guān)鍵細(xì)胞修復(fù)途徑之一[12-14]。

目前，自噬相關(guān)分子和趨化因子在OSAHS中的病理作用相關(guān)研究較少報(bào)道。本研究通過對(duì)不同嚴(yán)重程度OSAHS患者外周血中的自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1，及趨化因子CCL2、CCL5表達(dá)水平進(jìn)行研究，旨在探討其與OSAHS病情程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年9月～2020年8月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院綜合三科就診并接受治療的OSAHS患者90例為研究對(duì)象，患者包括輕度、中度和重度OSAHS患者，各30例，匹配同期健康對(duì)照30例。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 參照2011 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)睡眠呼吸障礙學(xué)組制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診療指南》[15]和2009年睡眠呼吸暫停與心血管疾病專家共識(shí)組制定的《睡眠呼吸暫停與心血管專家共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)》[16]，經(jīng)PSG 監(jiān)測(cè)提示每夜7 h 睡眠中呼吸暫停及低通氣反復(fù)發(fā)作在30 次以上或呼吸暫停低通氣指數(shù)(the Apnea-hypopnea index,AHI)>5 次/h診斷為OSAHS。按照AHI 值將OSAHS患者分為輕、中、重度，AHI 5～15 次/h為輕度； AHI 16～29 次/h為中度；重度：AHI>30 次/ h為重度。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有高脂血癥、糖尿病、肺部疾病、急慢性感染、惡性腫瘤、腦卒中、過敏性疾病、血液系統(tǒng)疾病等。②伴有心肝腎等重要臟器功能不全者。③既往接受過口腔矯正器和懸雍垂顎咽成形術(shù)等治療者。

1.4 方法

1.4.1 PSG監(jiān)測(cè) 采用多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)儀(PSG，美國衛(wèi)康公司)監(jiān)測(cè)患者的睡眠呼吸情況[17]，監(jiān)測(cè)時(shí)間為每晚7 h睡眠期間，并在檢測(cè)當(dāng)天，禁服鎮(zhèn)靜劑、催眠藥與咖啡因等，禁止飲酒；同步監(jiān)測(cè)睡眠腦電活動(dòng)、睡眠呼吸情況(包括腦電圖、口鼻氣流、胸式呼吸、腹式呼吸和SaO2)。所有數(shù)據(jù)自動(dòng)記錄并存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)內(nèi)，次日監(jiān)測(cè)結(jié)束后，人工判讀監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)后形成檢查報(bào)告。

1.4.2 ELISA檢測(cè)血漿中ATG16L1和Beclin 1水平 于PSG 監(jiān)測(cè)次日清晨，使用肝素鈉抗凝采血管收集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血4 mL，經(jīng)2000 r/min 離心15 min，分離上層血漿，置于4℃冰箱中待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)ATG16L1和Beclin 1表達(dá)水平，嚴(yán)格遵守試劑盒(ATG16L1 ELISA檢測(cè)試劑盒，上海晶抗生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AS521；Beclin 1 ELISA檢測(cè)試劑盒，上海一研生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：EY3592)說明書進(jìn)行。

1.4.3 分離外周血單核細(xì)胞 使用淋巴細(xì)胞分離液以Ficoll密度梯度法分離出外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，置-80℃冰箱保存。

1.4.4 RT-PCR檢測(cè)PBMC中趨化因子CCL2、CCL5的表達(dá) 將500 μL Trizol加入外周血單核細(xì)胞中進(jìn)行吹打混勻，混合液中加入200 μL氯仿進(jìn)行渦旋， 4℃離心20 min(12 000 r/min)，靜置后分離上清液，在上清液中加入預(yù)冷異丙醇，4℃離心15 min(12 000 r/min)，棄上清后加入無酶水1 mL，4℃離心15 min(12 000 r/min)，最終用10 μL DEPC 水加熱溶解沉淀。使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 引物由Invitrogen生物有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

PCR反應(yīng)過程和條件為：預(yù)變性：95℃下3 min；變性：95℃下30 s；退火時(shí)間0.05 s，延伸時(shí)間35 s，循環(huán)次數(shù)為35 次。以GAPDH 作為內(nèi)參， 將所得Ct 值按2-△△Ct 方法進(jìn)行處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用秩和檢驗(yàn)分析分類變量和連續(xù)變量，使用tukey法進(jìn)行組間比較。統(tǒng)計(jì)分析由SAS 9.4軟件完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 由Prism 8軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 4組一般資料的比較 對(duì)照組，輕度、中度和重度OSAHS組性別、年齡、體重指數(shù)(Body mass index,BMI)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而AHI和最低血氧飽和度比較，4個(gè)組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 研究對(duì)象一般情況比較

2.2 AHI與性別、BMI、年齡和最低血氧飽和度的相關(guān)性 將性別、BMI、年齡和最低血氧飽和度分別與AHI進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：性別、BMI、年齡的分布與AHI無明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.03、0.06和0.17，且3組相關(guān)系數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；最低血氧飽和度水平與AHI呈負(fù)相關(guān)，最低血氧飽和度相關(guān)系數(shù)為-0.93，見圖1。

圖1 性別、BMI、年齡和最低血氧飽和度水平與AHI相關(guān)性分析

2.3 各組外周血中自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1和趨化因子CCL2、CCL5表達(dá)情況 輕、中、重度OSAHS組血漿中自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1的濃度明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)；與對(duì)照組相比，輕、中、重度OSAHS組患者外周血單核細(xì)胞中趨化因子CCL2和CCL5 mRNA表達(dá)水平顯著升高(均P<0.01)，見表3。

表3 各組自噬相關(guān)分子和趨化因子表達(dá)水平比較

2.4 AHI與自噬相關(guān)分子、趨化因子表達(dá)水平的相關(guān)性 將ATG16L1、Beclin1、CCL2和CCL5分別與AHI進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：血漿中ATG16L1、Beclin1的表達(dá)水平與AHI呈負(fù)相關(guān)，ATG16L1和Beclin1相關(guān)系數(shù)均為-0.94，且兩組相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01)。外周血單核細(xì)胞中CCL2、CCL5的mRNA含量與AHI呈正相關(guān)，CCL2和CCL5的相關(guān)系數(shù)均為0.94，且兩組相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見圖2。

圖2 ATG16L1、Beclin1、CCL2和CCL5的表達(dá)水平與AHI相關(guān)性分析

3 討論

自噬是普遍存在于真核生物中正常代謝過程，具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)的作用[18]；作為重要的自我保護(hù)機(jī)制，自噬參與機(jī)體的多種代謝過程，影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[21-22]，自噬能減少及清除氧化應(yīng)激制造的損傷，減緩細(xì)胞死亡；而當(dāng)自噬過程被阻斷時(shí)，導(dǎo)致毒性蛋白質(zhì)聚集和線粒體功能損傷，從而進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激[23-25]。OSAHS患者存在一種很特殊的缺氧模式：間斷缺氧，表現(xiàn)為缺氧程度嚴(yán)重、血氧變化幅度大，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]。細(xì)胞在低氧條件下能通過上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)，激活BNIP3/BNIP3L及Beclin-1介導(dǎo)的通路誘導(dǎo)線粒體自噬，最終減少ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞的存活，使機(jī)體產(chǎn)生低氧適應(yīng)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，輕、中、重度OSAHS患者外周血單核細(xì)胞中CCL2和CCL5表達(dá)升高，血漿中Beclin1 和ATG16L1表達(dá)降低，并且OSAHS患者病情程度與外周血中自噬分子表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與趨化因子表達(dá)水平成正相關(guān)。此外，本研究團(tuán)隊(duì)前期連續(xù)8周每周檢測(cè)OSAHS患者自噬相關(guān)分子和趨化因子的表達(dá)水平，兩者表達(dá)水平較為穩(wěn)定，并未發(fā)現(xiàn)明顯動(dòng)態(tài)變化，且兩者表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

OSAHS患者的典型表現(xiàn)是慢性間斷性缺氧[28-29]。OSAHS患者長期間歇性缺氧、高碳酸血癥能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放大量炎癥因子[28]。有研究表明，自噬、炎癥和氧化應(yīng)激存在交互反應(yīng)，自噬水平降低可加重炎癥反應(yīng)[24]。趨化因子是由炎性細(xì)胞衍生的能夠趨化和激活各種白細(xì)胞的細(xì)胞因子，能夠引導(dǎo)白細(xì)胞亞群的定向游走和組織內(nèi)聚集；趨化因子CCL2、CCL5及其受體對(duì)免疫炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[30]。自噬水平降低導(dǎo)致趨化因子為代表的炎癥分子分泌增多，是誘發(fā)和加重OSAHS的重要調(diào)控機(jī)制之一。

目前，OSAHS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是PSG，AHI是評(píng)價(jià)其嚴(yán)重程度的主要指標(biāo)[31-32]。本研究顯示，OSAHS患者外周血中自噬相關(guān)分子ATG16L1和Beclin1水平降低，趨化因子CCL2和CCL5表達(dá)水平升高；并且CCL2、CCL5表達(dá)水平和AHI呈正相關(guān)，自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1表達(dá)水平和AHI呈負(fù)相關(guān)，提示自噬相關(guān)分子和趨化因子可能參與OSAHS的發(fā)生、發(fā)展。但由于本研究樣本量的局限性，自噬分子和趨化因子能否作為評(píng)價(jià)OSAHS嚴(yán)重程度的指標(biāo)，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，自噬相關(guān)分子、趨化因子與OSAHS的嚴(yán)重程度相關(guān)，為 OSAHS診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)和方向。

4 結(jié)論

OSAHS患者外周血中，自噬相關(guān)分子水平降低，趨化因子表達(dá)水平升高，并且兩者與OSAHS嚴(yán)重程度相關(guān)，提示兩者可能參與OSAHS的發(fā)生、發(fā)展。