羅云彥，謝紅月，潘 鵬，胡旭旭，甄 銳，蔣欽楊，黃艷娜

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004）

誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的DNA片段化因子45樣效應(yīng)物A（）是一種新的促凋亡蛋白家族成員，大部分儲(chǔ)存于棕色和白色脂肪中，通過(guò)控制脂滴（LDs）融合調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞和其他類型細(xì)胞中甘油三酯的沉積。表達(dá)量的高低與健康密切相關(guān)。基因可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞死亡和DNA片段化，是在具有熱生成能力的脂肪細(xì)胞中高表達(dá)的基因。的C末端可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，N末端的作用是抑制細(xì)胞的凋亡，與脂肪的消耗密切相關(guān)。主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體和LDs表面，是脂質(zhì)代謝途徑的重要調(diào)節(jié)劑。周林康研究表明，在小鼠及人的脂肪肝發(fā)生時(shí)，表達(dá)顯著增加，人肝臟細(xì)胞系及小鼠肝臟中過(guò)表達(dá)能夠明顯促進(jìn)脂類的積累。Zhou等研究表明，小鼠肝臟中基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肝脂質(zhì)積累增加和LDs形成。Nordstr?m等研究證實(shí)，患有基因缺乏癥的小鼠，能夠進(jìn)一步降低肝臟中的脂類積累。Li等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于敲除/Fsp27sh雙基因的小鼠脂質(zhì)存儲(chǔ)量顯著減少。龔婧怡研究表明，在基因敲除后，其發(fā)揮的作用缺失，脂肪細(xì)胞表達(dá)顯著受到抑制。

目前關(guān)于基因?qū)Χ砰L(zhǎng)大豬脂肪沉積的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在克隆杜長(zhǎng)大豬基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)通過(guò)qPCR檢測(cè)杜長(zhǎng)大豬不同組織中基因表達(dá)規(guī)律，明確杜長(zhǎng)大豬基因在不同組織中的表達(dá)情況，為后續(xù)研究基因在杜長(zhǎng)大豬脂肪沉積的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取110 kg杜長(zhǎng)大豬6頭（由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研基地養(yǎng)殖場(chǎng)提供）全部屠宰，在無(wú)菌條件下分別采集腹脂、皮下脂肪、肝臟、腎臟、肺臟、心臟及背最長(zhǎng)肌等組織，裝至標(biāo)記好的無(wú)菌凍存管中，最后整理放入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器 膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PMD18-T載體和熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司；酵母浸出物和胰蛋白胨等購(gòu)自O(shè)XOID公司；瓊脂糖購(gòu)自法國(guó)Biowest公司；大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。分析天平（型號(hào)：FB124）購(gòu)自上海恒平科學(xué)儀器有限公司；梯度PCR（型號(hào)：T100ThermalCycler）和伯樂(lè)Touch qPCR儀（型號(hào)：CFX96）均購(gòu)自伯樂(lè)公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上豬的基因序列（登錄號(hào)：NM_001112696.2）利用軟件Oligo7設(shè)計(jì)基因引物。分別設(shè)計(jì)克隆和定量的引物，并以18S為內(nèi)參基因。引物信息見(jiàn)表1，由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 樣品總RNA的提取及cDNA的合成 將樣品剪切100 mg于研缽內(nèi)進(jìn)行研磨，研磨成粉末狀后將其轉(zhuǎn)移到EP管中。利用Trizol法對(duì)杜長(zhǎng)大豬各組織中總RNA進(jìn)行提取，以提取的總RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增 普通PCR反應(yīng)體系10 μL：2×Taq PCR Master Mix 5 μL；cDNA（500 ng/μL）1 μL，上、下游引物（5.30 nmol/μL）各0.5 μL；RNase-free HO 3 μL。普通PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、56.4℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min；16℃保存。

1.6 電泳和膠回收 將普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1.5%的比例進(jìn)行瓊脂凝膠電泳；初步判斷產(chǎn)物的特異性。對(duì)于符合預(yù)期產(chǎn)物大小的DNA片段，利用DNA膠回收試劑盒對(duì)其片段進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物與PMD18-T載體進(jìn)行連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行涂布，第2天挑單個(gè)菌落于含有LB的EP管中。搖菌后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，將菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與目的基因預(yù)期一致，將PCR鑒定呈陽(yáng)性的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 生物信息學(xué)分析 通過(guò)DNASTAR中MegAlign軟件對(duì)獲得的杜長(zhǎng)大豬基因序列與NCBI已公布其他物種基因序列進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建多物種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。利用EXPASY在線軟件分析CIDEa蛋白親水性、理化性質(zhì)和等電點(diǎn)。利用NPS＠-SOPMA在線軟件分析杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL在線軟件分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.8 qPCR檢測(cè)杜長(zhǎng)大豬基因的表達(dá)情況 提取杜長(zhǎng)大豬組織總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行qPCR，每個(gè)組織樣品進(jìn)行3次重復(fù)。反應(yīng)體系10 μL：SYBRPremix Ex TaqTM II 5 μL，上下游引物（5 nmol/μL）各0.25 μL，DEPC水2 μL，cDNA（500 ng/μL）2.5 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 變性5 s、60℃ 30 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。按照2法計(jì)算杜長(zhǎng)大豬各組織中基因的相對(duì)表達(dá)量，采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行差異分析，利用GraphPad Prism 8.0.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 杜長(zhǎng)大豬基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 通過(guò)PCR方法克隆得到杜長(zhǎng)大豬基因CDS序列，其PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。將目的基因條帶與Maker條帶對(duì)比，結(jié)果表明，目的基因片段長(zhǎng)度與預(yù)期片段長(zhǎng)度829 bp一致。

圖1 杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪CIDEa基因PCR電泳結(jié)果

2.2 杜長(zhǎng)大豬基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 杜長(zhǎng)大豬基因差異位點(diǎn)分析 通過(guò)已公布的野豬基因序列與成功獲得杜長(zhǎng)大豬基因序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示共發(fā)生5處堿基突變，分別為第99 C-T、第355 T-C、第609 G-A和第627 C-T屬同義突變，第173位T-C脯氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

2.2.2 杜長(zhǎng)大豬基因同源性分析 由圖2可知，杜長(zhǎng)大豬基因與野豬（NM_001112696.2）、牛（登錄號(hào)：XM_024984288.1）、馬（登錄號(hào)：XM_005 612753.3）、犬（登錄號(hào)：XM_547681.6）、人（登錄號(hào)：NM_001279.4）、家鼠（登錄號(hào)：NM_007702.2）同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，同源性分別為99.2%、84.8%、81.5%、80.6%、80%、76.1%。由圖3可知，杜長(zhǎng)大豬與野豬的遺傳距離最近，與家鼠的遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖2 杜長(zhǎng)大豬與其他物種CIDEa基因CDS序列的同源性比對(duì)結(jié)果

圖3 基于CIDEa同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.3 CIDEa蛋白親疏水性分析 由圖4可知，杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白親水性平均值為-0.068，屬親水性蛋白。

圖4 杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果

2.4 CIDEa蛋白理化性質(zhì)分析 由表2可知，CIDEa蛋白分子質(zhì)量為24 371.48 u，分子式為CHNOS，等電點(diǎn)為9.67，不穩(wěn)定指數(shù)為52.05。杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白中亮氨酸（Leu）含量最高（13.3%），色氨酸（Trp）含量最低（0.5%）。

表2 杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白氨基酸組成

2.5 CIDEa蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu) 由圖5可知，杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋占45.41%，無(wú)規(guī)則卷曲占33.49%，延伸鏈占15.14%，-轉(zhuǎn)角占5.96%。杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白構(gòu)建的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖6所示。

圖5 杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

圖6 杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

2.6 杜長(zhǎng)大豬基因組織表達(dá)情況分析 由圖7可知，基因在腹脂和皮下脂肪中表達(dá)量最高，其次是肝臟、腎臟、肺臟和心臟，背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最低。

圖7 杜長(zhǎng)大豬CIDEa基因在不同組織的表達(dá)

3 討 論

脂肪沉積是動(dòng)物體內(nèi)能量貯存的主要方式。是脂質(zhì)代謝各個(gè)方面的重要調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)已獲得的杜長(zhǎng)大豬基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，杜長(zhǎng)大豬基因序列與野豬基因序列相比共發(fā)生5處堿基突變，其中第173位T-C脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?，該堿基突變是否會(huì)影響蛋白質(zhì)功能有待進(jìn)一步探究。CIDEa蛋白等電點(diǎn)為9.67，大于7，推測(cè)CIDEa蛋白為偏堿性蛋白。CIDEa蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為52.05，推測(cè)CIDEa蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)杜長(zhǎng)大豬CIDEa蛋白中亮氨酸含量高達(dá)13.3%，顯著高于其他物種CIDEa蛋白中亮氨酸含量，推測(cè)該結(jié)果是影響杜長(zhǎng)大豬生長(zhǎng)快、肉質(zhì)優(yōu)良的部分原因。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CIDEa蛋白的-螺旋含量最高，其次是無(wú)規(guī)則卷曲，延伸鏈和-轉(zhuǎn)角含量最低，表明CIDEa蛋白為常規(guī)蛋白?？紤]到本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)材料存在地區(qū)、來(lái)源及所選取個(gè)體的差異性，因此還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

前人研究表明，基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在脂肪組織中表達(dá)最高。黃柳梅研究肉雞中基因mRNA的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，肉雞中基因在脂肪中表達(dá)量最高，其次是腎臟和肝臟。Li等研究梅山豬基因在脂肪、肺、腎、肝、肌肉、心臟等組織的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在腹脂和皮下脂肪中mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織。李君等研究豫西脂尾羊基因在皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪組織中的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)基因在豫西脂尾羊皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪組織中mRNA表達(dá)量較高。Qiu等研究肥胖豬和瘦豬的脂肪組織，肝臟和骨骼肌中的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脂肪組織中基因的mRNA表達(dá)量顯著高于肝臟和骨骼肌。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腹脂、皮下脂肪、心臟、肝臟、腎臟、肺臟、背最長(zhǎng)肌中基因mRNA表達(dá)水平研究，發(fā)現(xiàn)基因腹脂和皮下脂肪基因mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織，在肝臟、腎臟、肺臟和心臟較高表達(dá)，在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最低。此外，基因如何在分子水平上調(diào)控脂肪沉積，進(jìn)而影響機(jī)體脂肪沉積以及對(duì)相關(guān)蛋白的調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功的獲得了杜長(zhǎng)大豬基因CDS區(qū)，共發(fā)現(xiàn)5處堿基突變，其中第173位由脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?；基因在杜長(zhǎng)大豬腹脂和皮下脂肪中表達(dá)量顯著高于其他組織。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)研究基因?qū)Χ砰L(zhǎng)大豬脂肪沉積的作用奠定基礎(chǔ)。