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        杜長大豬CIDEa基因克隆及其組織表達分析

        2022-01-20 03:51:08羅云彥謝紅月胡旭旭蔣欽楊黃艷娜
        中國畜牧雜志 2022年1期
        關鍵詞:亮氨酸皮下脂肪引物

        羅云彥,謝紅月,潘 鵬,胡旭旭,甄 銳,蔣欽楊,黃艷娜

        (廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧 530004)

        誘導細胞調亡的DNA片段化因子45樣效應物A()是一種新的促凋亡蛋白家族成員,大部分儲存于棕色和白色脂肪中,通過控制脂滴(LDs)融合調節(jié)脂肪細胞和其他類型細胞中甘油三酯的沉積。表達量的高低與健康密切相關?;蚩梢源龠M哺乳動物細胞中的細胞死亡和DNA片段化,是在具有熱生成能力的脂肪細胞中高表達的基因。的C末端可以誘導細胞凋亡,N末端的作用是抑制細胞的凋亡,與脂肪的消耗密切相關。主要定位于內質網、高爾基體、線粒體和LDs表面,是脂質代謝途徑的重要調節(jié)劑。周林康研究表明,在小鼠及人的脂肪肝發(fā)生時,表達顯著增加,人肝臟細胞系及小鼠肝臟中過表達能夠明顯促進脂類的積累。Zhou等研究表明,小鼠肝臟中基因過表達導致肝脂質積累增加和LDs形成。Nordstr?m等研究證實,患有基因缺乏癥的小鼠,能夠進一步降低肝臟中的脂類積累。Li等研究發(fā)現,對于敲除/Fsp27sh雙基因的小鼠脂質存儲量顯著減少。龔婧怡研究表明,在基因敲除后,其發(fā)揮的作用缺失,脂肪細胞表達顯著受到抑制。

        目前關于基因對杜長大豬脂肪沉積的作用鮮有報道。本實驗旨在克隆杜長大豬基因并進行生物信息學分析,同時通過qPCR檢測杜長大豬不同組織中基因表達規(guī)律,明確杜長大豬基因在不同組織中的表達情況,為后續(xù)研究基因在杜長大豬脂肪沉積的作用奠定基礎。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料 選取110 kg杜長大豬6頭(由廣西大學動物科學技術學院科研基地養(yǎng)殖場提供)全部屠宰,在無菌條件下分別采集腹脂、皮下脂肪、肝臟、腎臟、肺臟、心臟及背最長肌等組織,裝至標記好的無菌凍存管中,最后整理放入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 主要試劑與儀器 膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;PMD18-T載體和熒光定量反轉錄試劑盒等購自TaKaRa公司;酵母浸出物和胰蛋白胨等購自OXOID公司;瓊脂糖購自法國Biowest公司;大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。分析天平(型號:FB124)購自上海恒平科學儀器有限公司;梯度PCR(型號:T100ThermalCycler)和伯樂Touch qPCR儀(型號:CFX96)均購自伯樂公司。

        1.3 引物設計與合成 根據NCBI上豬的基因序列(登錄號:NM_001112696.2)利用軟件Oligo7設計基因引物。分別設計克隆和定量的引物,并以18S為內參基因。引物信息見表1,由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。

        表1 引物序列

        1.4 樣品總RNA的提取及cDNA的合成 將樣品剪切100 mg于研缽內進行研磨,研磨成粉末狀后將其轉移到EP管中。利用Trizol法對杜長大豬各組織中總RNA進行提取,以提取的總RNA為模板按照反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 PCR擴增 普通PCR反應體系10 μL:2×Taq PCR Master Mix 5 μL;cDNA(500 ng/μL)1 μL,上、下游引物(5.30 nmol/μL)各0.5 μL;RNase-free HO 3 μL。普通PCR反應程序:95℃預變性5 min;95℃變性30 s、56.4℃退火30 s、72℃延伸30 s,共35個循環(huán);72℃終延伸5 min;16℃保存。

        1.6 電泳和膠回收 將普通PCR擴增產物按照1.5%的比例進行瓊脂凝膠電泳;初步判斷產物的特異性。對于符合預期產物大小的DNA片段,利用DNA膠回收試劑盒對其片段進行回收。將回收產物與PMD18-T載體進行連接過夜。轉化后進行涂布,第2天挑單個菌落于含有LB的EP管中。搖菌后進行菌液PCR擴增,將菌液PCR產物進行瓊脂糖凝膠檢測。檢測結果與目的基因預期一致,將PCR鑒定呈陽性的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

        1.7 生物信息學分析 通過DNASTAR中MegAlign軟件對獲得的杜長大豬基因序列與NCBI已公布其他物種基因序列進行同源性比較,并構建多物種系統(tǒng)發(fā)育進化樹。利用EXPASY在線軟件分析CIDEa蛋白親水性、理化性質和等電點。利用NPS@-SOPMA在線軟件分析杜長大豬CIDEa蛋白二級結構,利用SWISS-MODEL在線軟件分析蛋白三級結構。

        1.8 qPCR檢測杜長大豬基因的表達情況 提取杜長大豬組織總RNA反轉錄為cDNA;以cDNA為模板進行qPCR,每個組織樣品進行3次重復。反應體系10 μL:SYBRPremix Ex TaqTM II 5 μL,上下游引物(5 nmol/μL)各0.25 μL,DEPC水2 μL,cDNA(500 ng/μL)2.5 μL。擴增程序:95℃預變性30 s;95℃ 變性5 s、60℃ 30 s,進行45個循環(huán)。按照2法計算杜長大豬各組織中基因的相對表達量,采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行差異分析,利用GraphPad Prism 8.0.1軟件對數據進行作圖分析。

        2 結果

        2.1 杜長大豬基因PCR擴增結果 通過PCR方法克隆得到杜長大豬基因CDS序列,其PCR擴增結果如圖1所示。將目的基因條帶與Maker條帶對比,結果表明,目的基因片段長度與預期片段長度829 bp一致。

        圖1 杜長大豬皮下脂肪CIDEa基因PCR電泳結果

        2.2 杜長大豬基因生物信息學分析

        2.2.1 杜長大豬基因差異位點分析 通過已公布的野豬基因序列與成功獲得杜長大豬基因序列進行對比,結果顯示共發(fā)生5處堿基突變,分別為第99 C-T、第355 T-C、第609 G-A和第627 C-T屬同義突變,第173位T-C脯氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

        2.2.2 杜長大豬基因同源性分析 由圖2可知,杜長大豬基因與野豬(NM_001112696.2)、牛(登錄號:XM_024984288.1)、馬(登錄號:XM_005 612753.3)、犬(登錄號:XM_547681.6)、人(登錄號:NM_001279.4)、家鼠(登錄號:NM_007702.2)同源性比對,結果顯示,同源性分別為99.2%、84.8%、81.5%、80.6%、80%、76.1%。由圖3可知,杜長大豬與野豬的遺傳距離最近,與家鼠的遺傳距離最遠。

        圖2 杜長大豬與其他物種CIDEa基因CDS序列的同源性比對結果

        圖3 基于CIDEa同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

        2.3 CIDEa蛋白親疏水性分析 由圖4可知,杜長大豬CIDEa蛋白親水性平均值為-0.068,屬親水性蛋白。

        圖4 杜長大豬CIDEa蛋白親/疏水性預測分析結果

        2.4 CIDEa蛋白理化性質分析 由表2可知,CIDEa蛋白分子質量為24 371.48 u,分子式為CHNOS,等電點為9.67,不穩(wěn)定指數為52.05。杜長大豬CIDEa蛋白中亮氨酸(Leu)含量最高(13.3%),色氨酸(Trp)含量最低(0.5%)。

        表2 杜長大豬CIDEa蛋白氨基酸組成

        2.5 CIDEa蛋白的二、三級結構 由圖5可知,杜長大豬CIDEa蛋白二級結構中-螺旋占45.41%,無規(guī)則卷曲占33.49%,延伸鏈占15.14%,-轉角占5.96%。杜長大豬CIDEa蛋白構建的三級結構如圖6所示。

        圖5 杜長大豬CIDEa蛋白二級結構的預測

        圖6 杜長大豬CIDEa蛋白三級結構的預測

        2.6 杜長大豬基因組織表達情況分析 由圖7可知,基因在腹脂和皮下脂肪中表達量最高,其次是肝臟、腎臟、肺臟和心臟,背最長肌中表達量最低。

        圖7 杜長大豬CIDEa基因在不同組織的表達

        3 討 論

        脂肪沉積是動物體內能量貯存的主要方式。是脂質代謝各個方面的重要調節(jié)因子。本實驗通過對已獲得的杜長大豬基因序列進行生物信息學分析發(fā)現,杜長大豬基因序列與野豬基因序列相比共發(fā)生5處堿基突變,其中第173位T-C脯氨酸突變?yōu)榱涟彼幔搲A基突變是否會影響蛋白質功能有待進一步探究。CIDEa蛋白等電點為9.67,大于7,推測CIDEa蛋白為偏堿性蛋白。CIDEa蛋白不穩(wěn)定指數為52.05,推測CIDEa蛋白的結構穩(wěn)定性較差。同時本研究還發(fā)現杜長大豬CIDEa蛋白中亮氨酸含量高達13.3%,顯著高于其他物種CIDEa蛋白中亮氨酸含量,推測該結果是影響杜長大豬生長快、肉質優(yōu)良的部分原因。二級結構預測結果顯示,CIDEa蛋白的-螺旋含量最高,其次是無規(guī)則卷曲,延伸鏈和-轉角含量最低,表明CIDEa蛋白為常規(guī)蛋白??紤]到本實驗所采用的實驗材料存在地區(qū)、來源及所選取個體的差異性,因此還需要進一步研究驗證。

        前人研究表明,基因在各個組織中均有表達,其中在脂肪組織中表達最高。黃柳梅研究肉雞中基因mRNA的表達量發(fā)現,肉雞中基因在脂肪中表達量最高,其次是腎臟和肝臟。Li等研究梅山豬基因在脂肪、肺、腎、肝、肌肉、心臟等組織的mRNA表達,發(fā)現在腹脂和皮下脂肪中mRNA表達量顯著高于其他組織。李君等研究豫西脂尾羊基因在皮下脂肪和內臟脂肪組織中的mRNA表達,發(fā)現基因在豫西脂尾羊皮下脂肪和內臟脂肪組織中mRNA表達量較高。Qiu等研究肥胖豬和瘦豬的脂肪組織,肝臟和骨骼肌中的基因表達,發(fā)現脂肪組織中基因的mRNA表達量顯著高于肝臟和骨骼肌。本實驗通過對腹脂、皮下脂肪、心臟、肝臟、腎臟、肺臟、背最長肌中基因mRNA表達水平研究,發(fā)現基因腹脂和皮下脂肪基因mRNA表達量顯著高于其他組織,在肝臟、腎臟、肺臟和心臟較高表達,在背最長肌中表達量最低。此外,基因如何在分子水平上調控脂肪沉積,進而影響機體脂肪沉積以及對相關蛋白的調控機制也有待進一步的研究。

        4 結 論

        本實驗成功的獲得了杜長大豬基因CDS區(qū),共發(fā)現5處堿基突變,其中第173位由脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?;基因在杜長大豬腹脂和皮下脂肪中表達量顯著高于其他組織。本實驗結果可為后續(xù)研究基因對杜長大豬脂肪沉積的作用奠定基礎。

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