譚建林，彭珍華，趙秀琳，馬雪濤，張雪媛，劉曉林，胡贈彬，馮 雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院/國家熱帶農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗中心, 云南昆明 650223）

氨基甲酸酯類農(nóng)藥殺蟲效果明顯，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛[1]，但其對人畜有急性毒性作用，同時農(nóng)產(chǎn)品中殘留氨基甲酸酯類農(nóng)藥對公眾危害較大[2-3]。因此，我國和其他許多國家和地區(qū)對氨基甲酸酯類農(nóng)藥在食品中的殘留制定了限量標準[4-5]，歐盟規(guī)定禽蛋中涕滅威的最高殘留量為：0.01 mg/kg；滅多威的最高殘留量為：0.02 mg/kg；呋線威、丙硫克百威和殘殺威的最高殘留量為：0.05 mg/kg[3]，而我國GB2763規(guī)定了蛋類中丁硫克百威、滅多威、殺線威和霜霉威的最大殘留量分別為：0.05、0.02、0.02和0.01 mg/kg，其他氨基甲酸酯類殺蟲劑并未作限量要求[4]。

目前我國檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標準主要有酶抑制法[6-7]、液相色譜-柱后衍生法[8-10]、氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-19]。近年來，一些生產(chǎn)者為了降低雞的病死率，在生產(chǎn)過程中濫用各種農(nóng)藥和獸藥。從歐洲爆出雞蛋中氟蟲腈污染的食品安全事件[20]，使人們對雞蛋中農(nóng)獸殘的關注日益增加，但是國內(nèi)目前對雞蛋中農(nóng)藥殘留的研究較少，主要采用氣相色譜法[21]。由于氟蟲腈事件，關于雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留的研究和標準相對較多[22-24]，但目前還未有雞蛋中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測標準。此外，氨基甲酸酯類農(nóng)藥相關檢測標準和應用中的前處理大多采用固相萃取小柱進行凈化[8-10,25-26]，前處理成本高、耗時長、步驟繁瑣，運用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective,rugged and safe）方法對提取液進行凈化，操作簡單、效率高。本研究建立了同時測定雞蛋中的19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留量的快速分析方法，為蛋類樣品中農(nóng)殘標準的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 本地農(nóng)貿(mào)市場采購（每批采購數(shù)量：1 kg）；乙腈 色譜純，德國默克集團；氯化鈉 分析純，四川西隴化工有限公司；甲酸銨 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；標準品（100 μg/mL）：19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥（二氧威、惡蟲威、殘殺威、乙硫苯威、仲丁威、甲硫威、猛殺威、農(nóng)蟲威、甲萘威、滅多威、茚蟲威、抗蚜威、乙霉威、霜霉威、丁硫克百威、異丙威、殺線威、克百威（3-羥基克百威）、涕滅威（涕滅威砜、涕滅威亞砜）） 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

LC-MS 8050串聯(lián)質(zhì)譜儀 日本島津公司；0.1 mg和0.01 mg分析天平 瑞士梅特勒公司；TGL-20B高速離心機 上海安亭科學儀器廠；Milli-Q超純水儀 德國默克化工技術有限公司；KQ-800DE超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX2渦旋振蕩器 德國IKA集團；Research? plus 20～200 μL、10～1000 μL移液槍 德國 Eppendorf 公司；PSA/C18凈化管（100 mg/100 mg） 上海安譜實驗科技股份有限公司；C18E小柱（500 mg/6 mL） 月旭科技（上海）股份有限公司；HLB小柱（200 mg/3 mL） 島津（上海）實驗器材有限公司；NH2小柱（200 mg/3 mL） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 取1 kg雞蛋去殼后混合均勻（GB 2763 附錄A），稱取2 g試樣至50 mL 離心管，加入2 g氯化鈉和10 mL乙腈，渦旋2 min，冰浴冷卻，8000 r/min條件下離心10 min，取1.0 mL上清液到PSA/C18凈化管中，渦旋1 min，靜置5 min，取上清液過0.22 μm有機微孔濾膜至樣品瓶中，待測定。

1.2.2 標準溶液配制 標準儲備液：準確移取各氨基甲酸酯類農(nóng)藥標準品（100 μg/mL）1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成10 μg/mL的標準儲備液，于-18 ℃冰箱保存。

混合標準溶液：分別準確移取各氨基甲酸酯類農(nóng)藥標準儲備液1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成400 ng/mL的混合標準溶液，于-18 ℃冰箱保存。

標準工作溶液：準確移取適量混合標準溶液，用乙腈稀釋，配制成濃度為0.2、1、5、10、20和50 ng/mL的混合標準工作溶液。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件 采用Penomenex Kinetex 1.7 μ XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品溫度8 ℃；流動相A：10 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸），流動相B：乙腈；流速0.4 mL/min；進樣量5 μL。梯度洗脫程序：0 min，流動相B：25%；0～2.8 min，流動相B：25%～95%；2.8～4.0 min，流動相B：95%～95%；4.1～6.0 min，流動相B：25%～25%。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）：多反應監(jiān)測（MRM），霧化氣流量：2.8 L/min；加熱氣和干燥氣流量：10 L/min；接口溫度：300 ℃；DL溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃，接口電壓：4.0 kV；碰撞氣為氬氣。定量離子對和定性離子對見表1（定量及定性方法參考歐盟《食品飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法確認的指導文件SANTE/11945/2015》）。

表1 化合物的離子對、線性方程、相關系數(shù)、回收率、相對標準偏差（n=6）、檢出限和基質(zhì)效應Table 1 Ion pair, linear equations, correlation coefficients, recoveries, relative standard deviations （RSDs）, LOD and ME for analytes （n=6）

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均在島津公司的LabSolutions Version 5.89軟件下進行采集以及對數(shù)據(jù)結(jié)果定量和定性分析，相對標準偏差實驗重復為6次。采用Execl 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和表格制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相選擇

一般來說，采用串聯(lián)質(zhì)譜法分析氨基甲酸酯類農(nóng)藥的流動相為0.1%甲酸水溶液/乙腈[15-17]，電噴霧離子源正離子模式下在流動相中加入一定量的甲酸、甲酸銨、乙酸銨等，可以增加目標離子的離子化狀態(tài)，提高目標物離子化效率，改善峰形，提高分離度。本實驗分別采用A組：0.1%甲酸水溶液/乙腈、B組：5 mmol/L乙酸銨水溶液/乙腈和C組：0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨溶液/乙腈作為流動相進行分析。如圖1所示，以5 mmol/L乙酸銨水溶液/乙腈分析時，與0.1%甲酸水溶液/乙腈相比較，除霜霉威外的其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥的出峰時間均縮短，靈敏度也在一定程度上提高，但霜霉威存在嚴重拖尾情況，這表明甲酸銨的加入可提高氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度，為解決霜霉威的拖尾現(xiàn)象，在甲酸銨溶液中加入0.1%甲酸，很好的解決了該現(xiàn)象，最終以0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨溶液/乙腈作為流動相進行分析時，19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物的響應相對是最高的，峰形最優(yōu)，無拖尾情況，因而采用C組作為流動相。

圖1 流動相選擇Fig.1 Mobile phase selection

2.2 凈化小柱選擇

本研究檢測的農(nóng)藥在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，但是極性相差很大，對凈化小柱的選擇尤為重要。HLB小柱對堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度；NH2小柱可以有效去除樣品中的磺酸根離子等強陰離子和糖類等高極性有機化合物；PSA吸附劑對脂肪酸結(jié)構(gòu)化合物具有較強的吸附作用；C18可以去除非極性化合物。本實驗采用四種不同類型填料的小柱分別進行凈化，四種凈化小柱分別為：C18E小柱、HLB小柱、NH2小柱和C18/PSA凈化管?？瞻纂u蛋樣品先加入1 mL的混合標準溶液（1 μg/mL），經(jīng)1.2.1方法處理，提取完成后分別取2 mL用四種凈化小柱進行凈化（使用前活化），以目標物回收率為評價指標比較不同的凈化效果，結(jié)果如圖2所示。對于氨基甲酸酯類農(nóng)藥來說，C18E小柱回收率最差（回收率為23.6%～67.2%，最低為霜霉威：23.6%，最高為殘殺威：67.2%），其次是HLB小柱（回收率為53.2%～111.0%，最低為棉鈴威：53.2%，最高為霜霉威：111.0%），NH2小柱和C18/PSA凈化管獲得的回收率較好（NH2小柱回收率為：63.8%～126.2%，最低為棉鈴威：63.8%，最高為霜霉威：126.2%；C18/PSA凈化管小柱回收率為：66.5%～110.9%，最低為異丙威：66.5%，最高為丁硫克百威：110.9%），22種化合物，NH2小柱對其中3種農(nóng)藥殘留回收率最高，C18/PSA對其中18種農(nóng)藥殘留回收率最高，相對于其他的三種凈化方式，C18/PSA凈化效果好、回收率高，且操作簡單、前處理效率高，適合大批量的樣品檢測，同時可以有效吸附雞蛋中脂肪等雜質(zhì)。因此選用C18/PSA凈化管作為雞蛋中氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測的凈化方式。

圖2 四種凈化小柱對目標物回收率的影響Fig.2 Effect of four kinds of purification columns on the recovery of target materials

2.3 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應（ME：Matrix Effect）指樣品中其他成分對目標待測物測定值的影響，即基質(zhì)對分析方法準確測定分析物能力的干擾[24]。本實驗采用乙腈對雞蛋進行提取，提取液中可能含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)，均可能產(chǎn)生基質(zhì)效應。采用提取后添加的方法，通過比較以乙腈為溶劑和空白提取溶液為溶劑，分別配制0.2、1、5、10、20、50 ng/mL的系列標準工作溶液，以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。比較乙腈溶劑與基質(zhì)標準曲線的斜率，評估雞蛋的基質(zhì)效應?；|(zhì)效應（%）=（空白基質(zhì)標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率）/溶劑標準曲線的斜率×100[27-28]。ME值如果是正，則是正效應，基質(zhì)可提高目標物效應，ME值如果是負，則是負效應，基質(zhì)可降低目標物效應?；|(zhì)效應 按 其 絕 值|ME|分 為3個 等 級[29-30]：0%＜|ME|≤20%，是弱基質(zhì)效應；20%＜|ME|≤50%，是中等強度基質(zhì)效應；|ME|＞50%，是強基質(zhì)效應。從表1中可以看出，雞蛋樣品不同的氨基甲酸酯類農(nóng)藥，基質(zhì)效應是不同的，22種化合物，4種ME＞0，18種ME＜0，全部為弱基質(zhì)效應（0%＜|ME|≤20%）。因此，本實驗無需使用樣品基質(zhì)來配制基質(zhì)標準工作曲線，有效的節(jié)約成本和縮短前處理時間。

2.4 方法評價

采用1.2.3儀器條件對0.2～50 ng/mL的氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標準溶液進行測定，由表1可見，各標準曲線相關系數(shù)（R2）均大于0.999，結(jié)果說明了本實驗的檢測方法在其線性范圍內(nèi)的線性相關性良好。標準物質(zhì)色譜圖見圖3，圖中峰號所對應農(nóng)藥名稱見表1。

圖3 19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物色譜圖Fig.3 Chromatogram of 19 carbamate pesticides and metabolites residues

方法檢出限是依據(jù)1.2.2操作步驟，制備不含目標氨基甲酸酯類農(nóng)藥的空白基質(zhì)樣品提取液，逐級稀釋氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標準溶液，當定量離子對和定性離子對的信噪比為3時所對應的含量為檢出限。19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥因其理化性質(zhì)不同，在色譜柱上保留時間和質(zhì)譜上離子化效率不同，猛殺威、抗蚜威、霜霉威、丁硫克百威和克百威響應相對較好，檢出限較低；其余氨基甲酸酯類農(nóng)藥離子化效率相對較小，因此檢出限也較高。19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物的檢出限結(jié)果見表1。

選取陰性的典型樣品，向試樣中添加氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標準溶液，分別進行10、20、50 μg/kg（農(nóng)蟲威檢出限、2倍農(nóng)蟲威檢出限和5倍農(nóng)蟲威檢出限）的加標回收實驗，每份樣品檢測6次，實驗結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明本方法的回收率為69.3%～107.6%，相對標準偏差小于9.21%。說明該方法對雞蛋中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物的測定，具有良好的準確度和精密度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.5 樣品測定結(jié)果

采用本檢驗方法對市場上采購的20批雞蛋進行19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留檢測，以保留時間、定性離子對和離子對豐度比進行定性分析，以定量離子對進行定量分析。20批雞蛋樣品均未檢出19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留。

3 結(jié)論

本方法用乙腈進行提取，采用QuEChERS方式進行凈化，優(yōu)化了流動相和凈化小柱，考察了不同的凈化方式和雞蛋樣品的基質(zhì)效應，建立了雞蛋中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法前處理過程快速簡單，能實現(xiàn)大批量樣品的快速處理，方法的檢出限、精密度、穩(wěn)定性和線性關系均滿足19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留的分析檢測要求。