王民申，李 勇，馮 進，李春陽, ，侯萬偉，Oluwole Oluwatoyin Bolanle，Chuon Mony Roth

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150076；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 江蘇南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所, 江蘇南京 210014；4.青海省農(nóng)林科學(xué)院, 青海西寧 810000；5.奧肖迪聯(lián)邦工業(yè)研究所食品技術(shù)部, 尼日利亞拉各斯 999062；6.柬埔寨農(nóng)業(yè)漁業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品和食品實驗室, 柬埔寨金邊 10103）

黃漿水是在豆制品（如豆干、千張和豆腐等）生產(chǎn)過程中排放的富含蛋白質(zhì)、低聚糖、異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)的乳黃色不透明廢水[1]，據(jù)不完全統(tǒng)計，每加工1 t大豆約排放2～5 t黃漿水[2]。長期以來，大部分黃漿水被直接排放，其中蛋白質(zhì)等有機物也一起大量流失，造成了嚴重的環(huán)境污染[3]。因此充分回收黃漿蛋白、低聚糖和異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)，提高其利用效率，不僅具有一定的經(jīng)濟價值，同時還可以緩解排放黃漿水帶來的環(huán)境污染問題[4]。

目前，黃漿水營養(yǎng)成分回收利用方式有：富集與提取[5-8]、二次加工[9-10]、發(fā)酵處理[11-13]、單室微生物燃料電池處理[14]以及香蒲植物修復(fù)[15]等。此外，絮凝工藝[16-17]也是沉降黃漿中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分的一種重要方法，可以有效降低黃漿水中可溶性固形物的含量，回收其中的營養(yǎng)物質(zhì)[16]，降低黃漿水生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）和化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD），從而減少環(huán)境污染。

目前關(guān)于黃漿水絮凝工藝的研究主要集中在絮凝劑的選擇以及對黃漿水中單個組分的回收利用方面，而對于復(fù)配絮凝劑、絮凝工藝的優(yōu)化及多種成分同時絮凝回收利用的研究相對較少[1,16-17]。本實驗在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了復(fù)配絮凝劑對絮凝黃漿水中可溶性固形物的工藝參數(shù)，通過代謝組學(xué)分析探究黃漿水中小分子物質(zhì)在絮凝前后的變化，同時測定分析絮凝前后黃漿水的蛋白質(zhì)含量、總糖含量發(fā)現(xiàn)其中營養(yǎng)物質(zhì)變化的規(guī)律，為有效控制黃漿水污染，開發(fā)利用其營養(yǎng)成分，提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃漿水 南京市鴻味豆制品廠；殼聚糖 生物試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司（脫乙酰度 80～95，粘度50～800 mPa·s）；海藻酸鈉 化學(xué)純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、冰乙酸 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸 分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；試驗用水為去離子水，除說明外其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

JY-502電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海江星儀器有限公司；NANOSTAR7.5digital懸臂攪拌器 艾卡儀器設(shè)備有限公司；CSY-G2可溶性固形物含量檢測儀 深圳市芬析儀器制造有限公司（測定范圍：0.01%～100%，可讀性：0.01%）；L3-5K臺式低速離心機 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；LC-QTOF-MS為高效液相色譜（安捷倫1260）串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（AB SCIEX QTOF 5600+） 安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 絮凝工藝 取黃漿水原液（yellow serofluid）100 mL，添加殼聚糖和海藻酸鈉（殼聚糖和海藻酸鈉分別使用3%的冰乙酸和去離子水配置成3%的溶液使用），調(diào)節(jié)pH（1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH）和溫度，在恒溫水浴鍋中用機械攪拌器對其進行攪拌，攪拌時間為20 min，攪拌速度為120 r/min，取出絮凝后的黃漿水進行離心，4000 r/min離心10 min，將絮凝后的上清液收集，稱為絮凝液（supernatant），使用可溶性固形物含量檢測儀測定原液及絮凝液中可溶性固形物含量。

1.2.2 單因素實驗 按照1.2.1中的提取方法，實驗基本條件為：殼聚糖0.5 mg/mL，海藻酸鈉0.2 mg/mL，pH4.5，溫度35 ℃。單因素實驗條件為殼聚糖添加量為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL；海藻酸鈉添加量為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL；pH為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5；溫度設(shè)定為15、25、35、45、55 ℃，分別考察殼聚糖添加量、海藻酸鈉添加量、pH和溫度對可溶性固形物沉降率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上采用Box-Benhnken的組合設(shè)計對絮凝工藝沉降黃漿水可溶性固形物工藝進行優(yōu)化，以可溶性固形物沉降率為響應(yīng)值，響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素和水平表見表1。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗結(jié)果進行驗證實驗，并比較預(yù)測可溶性固形物沉降率與實際可溶性固形物沉降率。

表1 響應(yīng)面分析實驗因素及水平Table 1 Independent variable and their levels of response surface methodology

1.2.4 可溶性固形物沉降率的計算 按照公式（1）計算：

式（1）中：可溶性固形物沉降率簡稱為沉降率，SR（sedimentation rate）表示沉降率，%，F(xiàn)1為黃漿水原液中可溶性固形物含量，%，F(xiàn)2為絮凝液中可溶性固形物含量，%。

1.2.5 蛋白質(zhì)及總糖含量的測定 蛋白質(zhì)含量參照GB5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》進行測定；總糖含量測定參照苯酚-硫酸法[18]，移取1 mg/mL葡萄糖標準溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，分別置于8個100 mL的容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，制成不同濃度的標準溶液。然后從各瓶中分別移取2.00 mL標準溶液置于試管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，迅速加入5 mL濃硫酸，于室溫靜置20 min，后在490 nm處測吸光度。繪制得葡萄糖標準曲線為Y=4.65x-0.0016（其中Y為吸光度，A；x為葡萄糖濃度，g/L），R2=0.9995。移取2.00 mL樣品稀釋液，加入到25 mL試管中，加入1 mL 6%苯酚溶液，迅速加入5 mL濃硫酸，于室溫靜置20 min，后在490 nm處測吸光值，帶入標準曲線，計算含量。

1.2.6 生化需氧量（BOD）和化學(xué)需氧量（COD）的測定 BOD的測定參照HJ 505-2009水質(zhì) 五日生化需氧量（BOD5）的測定 稀釋與接種法進行；COD的測定參照HJ828-2017水質(zhì) 化學(xué)需氧量的測定 重鉻酸鹽法進行。

1.2.7 黃漿水代謝組學(xué)測定 將黃漿水原液和絮凝液進行LC-QTOF-MS檢測，分析其中的化學(xué)組成[19]。LC-QTOF-MS的色譜柱條件為X Select HSS T3（4.6 mm×150.0 mm，3.5 μm），正電離模式流動相為0.1%甲酸/水（A）和乙腈（B），負電離模式流動相為0.005 mol/L乙酸銨（A）和乙腈（B）。流動相梯度洗脫程序為：0～3.00 min，10% B；3.00～21.00 min，10%～95% B；21.00～28.00 min，95% B；28.00～28.10 min，95%～10% B；28.10～34. 00 min，10% B。

LC-QTOF-MS的質(zhì)譜條件選擇QTOF-MS全掃描模式和信息相關(guān)分析（IDA），質(zhì)量掃描范圍為m/z 50～1000，正、負電離模式的源電壓分別為5500 V和4500 V，簾氣、霧化器（gas1）和加熱氣體（gas2）的流動壓力分別為25、50和50 psi。碰撞能量（CE）分別為30 V和-30 V。利用MS-DIAL軟件對LCQTOF-MS數(shù)據(jù)進行分析，通過分析保留時間、質(zhì)量精度和同位素比值以及與公共數(shù)據(jù)庫（包括MassBank、LipidBlast、GNPS、Metabo BASE）進行MS/MS相似性匹配來進行化合物鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗數(shù)據(jù)分析及顯著性檢驗采用Origin9.6軟件進行分析，響應(yīng)面優(yōu)化試驗采用Design-Expert8.0.6軟件進行設(shè)計及結(jié)果與方差分析，顯著水平P＜0.05。所有試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 殼聚糖添加量對可溶性固形物沉降率的影響由圖1可知，隨著殼聚糖添加量的增加，沉降率明顯上升，殼聚糖在絮凝過程中起著主要作用，當殼聚糖添加量為0.5 mg/mL時，此時沉降率最高為40.86%，可溶性固形物與殼聚糖充分結(jié)合達到平衡，可溶性固形物-殼聚糖二元復(fù)合物的濃度趨于飽和且形成穩(wěn)定的絮體。當添加量超過0.5 mg/mL時，沉降率下降的主要原因是隨著殼聚糖添加量的增加，溶液逐漸形成膠狀懸浮體，其粘度也隨之增大，可溶性固形物析出困難，導(dǎo)致沉降率降低[16,20]。因此，最優(yōu)的殼聚糖添加量為0.5 mg/mL。

圖1 殼聚糖含量對可溶性固形物沉降率的影響Fig.1 Effect of chitosan content on sedimentation rate of soluble solid

2.1.2 海藻酸鈉添加量對可溶性固形物沉降率的影響 由圖2可知，當海藻酸鈉添加量為0.2 mg/mL時，沉降率最高為39.97%，隨著海藻酸鈉添加量逐漸增高，沉降率呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為殼聚糖是帶正電的堿基多糖，在黃漿水中通過靜電吸附作用進行絮凝形成絮體。海藻酸鈉是一種陰離子多糖，殼聚糖和海藻酸鈉通過靜電作用吸附可溶性固形物，當海藻酸鈉添加量超過0.2 mg/mL時，使復(fù)合絮凝劑的平衡狀態(tài)破壞導(dǎo)致黃漿水中的絮體不穩(wěn)定[16,21]。因此，最優(yōu)的海藻酸鈉添加量為0.2 mg/mL。

圖2 海藻酸鈉含量對可溶性固形物沉降率的影響Fig.2 Effect of sodium alginate content on sedimentation rate of soluble solids

2.1.3 pH對可溶性固形物沉降率的影響 由圖3可知，隨著pH的增加，沉降率逐漸增加，在pH為4.5時沉降率達到最高，此時可溶性固形物的沉降率為42.67%，隨著pH的繼續(xù)增大，沉降率呈現(xiàn)下降趨勢。當pH為4.5時接近大豆乳清蛋白的等電點，溶解度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)析出。同時在酸性條件下，殼聚糖的NH3+基團和海藻酸鹽的COO-基團在靜電力的作用下相互反應(yīng)形成復(fù)合物，復(fù)合物對蛋白質(zhì)和糖等可溶性固形物有較高的吸附性，可溶性固形物析出增多后導(dǎo)致可溶性固形物含量明顯下降[19]。因此，最優(yōu)的絮凝pH為4.5。

圖3 pH對可溶性固形物沉降率的影響Fig.3 Effect of pH on sedimentation rate of soluble solids

2.1.4 溫度對可溶性固形物沉降率的影響 由圖4可知，當溫度逐漸升高時，沉降率逐漸上升，當溫度升高至45 ℃時，此時沉降率最高為46.71%，超過45 ℃時，沉降的效果反而下降，此時絮體因為溫度過高不穩(wěn)定，導(dǎo)致可溶性固形物含量下降的效果不好。這可能是因為溫度過高導(dǎo)致黃漿水中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，使其與絮凝劑結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而從絮凝劑解析下來，導(dǎo)致可溶性固形物沉降率的下降[22]。因此最優(yōu)的絮凝溫度為45 ℃。

圖4 溫度對可溶性固形物沉降率的影響Fig.4 Effect of temperature on sedimentation rate of soluble solids

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

2.2.1 實驗設(shè)計方案與實驗結(jié)果 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Behnken的中心組合原理設(shè)計了29組試驗，試驗結(jié)果見表2。試驗結(jié)果使用Design-Expert 8.0.6軟件進行擬合分析。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 RSM design and test results

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 對可溶性固形物沉降率的響應(yīng)面實驗結(jié)果進行回歸分析，結(jié)果見表3。對四個因素進行回歸擬合后得到回歸方程Y（可溶性固形物沉降率）=45.99+4.55A+2.12B-2.29C+1.03D+2.07AB+1.27AC+0.67AD+2.21BC+1.27BD+1.93CD-6.69A2-3.45B2-3.39C2-5.42D2，由方差分析可知回歸方程模型極顯著（P＜0.0001），失擬項不顯著（P＞0.05），R2=0.9690，Radj2=0.9380，說明此模型與實際擬合較好，實驗方法可靠，所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，因此可以用此回歸方程代替真實實驗點分析實驗結(jié)果。結(jié)果表明，殼聚糖添加量（A）、海藻酸鈉添加量（B）、pH（C）、溫度（D）、殼聚糖添加量與海藻酸鈉添加量交互項（AB）、pH與海藻酸鈉添加量交互項（BC）、殼聚糖添加量與溫度交互項（CD）和各因素二次項對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），各個因素對響應(yīng)值的影響顯著性排序為A＞C＞B＞D。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

兩因素之間的交互作用響應(yīng)面圖見圖5。通過響應(yīng)曲面立體圖可以清晰地看出各因素之間的相互作用對可溶性固形物沉降率的影響作用。殼聚糖添加量（A）與海藻酸鈉添加量（B）的等高線圖以及pH（C）與溫度（D）的等高線圖形狀呈橢圓，三維圖曲面陡峭，表明殼聚糖添加量與海藻酸鈉添加量之間交互作用以及pH與溫度交互作用明顯且對可溶性固形物沉降率影響顯著。殼聚糖添加量（A）和pH（C）的等高線圖、殼聚糖添加量（A）與溫度（D）的等高線圖以及海藻酸鈉添加量（B）與溫度（D）等高線圖形狀接近圓形，表明殼聚糖添加量與pH之間交互作用、殼聚糖添加量與溫度之間交互作用以及海藻酸鈉添加量與溫度之間的交互作用不顯著。海藻酸鈉添加量（B）和pH（C）等高線圖形狀呈橢圓，三維圖曲面陡峭，表明海藻酸鈉添加量與pH之間交互作用明顯，且對可溶性固形物沉降率影響極顯著。與表3中的分析結(jié)果一致。

圖5 兩因素的交互作用對可溶性固形物沉降率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on sedimentation rate of soluble solids

2.2.3 驗證實驗 經(jīng)Design-Expert8.0.6預(yù)測模型極值點，結(jié)果顯示最佳提取條件為：殼聚糖添加量為0.54 mg/mL，海藻酸鈉添加量為0.24 mg/mL，pH為4.42，溫度為46.57 ℃，此時可溶性固形物沉降率45.46%。根據(jù)實際操作設(shè)計驗證實驗，其實驗條件設(shè)置為殼聚糖添加量0.54 mg/mL，海藻酸鈉添加量0.24 mg/mL，pH4.4，溫度47 ℃，按此提取條件進行3次平行實驗，在此條件下的固形物沉降率為（46.26%±0.38%），驗證實驗結(jié)果與預(yù)測值接近，表明該模型擬合度良好，對工藝優(yōu)化合理、有效。

2.3 絮凝對蛋白質(zhì)含量及總糖含量的影響

黃漿水中蛋白質(zhì)和糖類是其主要的組成成分[4]。在響應(yīng)面最佳優(yōu)化條件下，殼聚糖添加量為0.54 mg/mL，海藻酸鈉添加量為0.24 mg/mL，pH調(diào)節(jié)為4.4，溫度為47 ℃，測定絮凝前后蛋白質(zhì)含量和總糖含量，結(jié)果見表4。使用最佳絮凝工藝處理后原液與絮凝液蛋白含量差異顯著，下降幅度為40.68%，絮凝過程中吸附蛋白效果較好，絮凝劑與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的絮體在黃漿水中沉降析出。絮凝前后黃漿水中總糖濃度兩者之間無顯著性差異（P＞0.05），總糖含量下降率為8.41%，表明絮凝對黃漿水中糖類的吸附作用不明顯，糖類析出較少，主要存在于絮凝液中。對絮凝沉降得到的物質(zhì)進行真空冷凍干燥，測得其中蛋白質(zhì)純度為（63.21%±0.48%），蛋白純度較高，可以看出蛋白質(zhì)是絮凝沉降物質(zhì)中主要成分。此技術(shù)工藝簡單易行，條件溫和，可用于工業(yè)生產(chǎn)回收黃漿水中的蛋白質(zhì)，也可與其他工藝結(jié)合起來使用，例如膜分離超濾工藝處理黃漿水，可以實現(xiàn)大分子蛋白質(zhì)和小分子糖類的體系化的分離回收。

表4 蛋白質(zhì)含量及總糖含量的變化Table 4 Changes in protein and total sugar contents

2.4 絮凝對BOD及COD的影響

在響應(yīng)面最佳優(yōu)化條件下，測量絮凝前后黃漿水的BOD與COD，結(jié)果見表5。使用最佳絮凝工藝處理后，黃漿水的BOD去除率為43%，COD去除率為40.95%，二者降低幅度較大，絮凝工藝對降低BOD與COD具有顯著效果（P＜0.05）。這是因為絮凝物質(zhì)中蛋白質(zhì)等有機物析出，使得BOD和COD降低，所以絮凝工藝可以有效的降低黃漿水對環(huán)境的污染，同時回收黃漿水中的蛋白質(zhì)。絮凝工藝簡潔省時，可用于工業(yè)化生產(chǎn)，對保護環(huán)境及大豆產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展具有重要的意義。

表5 BOD及COD的變化Table 5 Changes of BOD and COD

2.5 代謝組學(xué)分析

對黃漿水原液和絮凝液進行LC-QTOF-MS鑒定其中的小分子化合物，采用主成分分析法（PCA）和層次聚類分析（熱圖）對LC-QTOF-MS數(shù)據(jù)進行判別分析[23-25]。如圖6所示，在PCA得分圖中黃漿水原液和絮凝液出現(xiàn)明顯的離散型，表明黃漿水原液和絮凝液在化學(xué)組成方面存在顯著差異。在熱圖圖7中，LC-QTOF-MS分析鑒定出原液和絮凝液中66種化合物具有顯著性差異（P＜0.05）。其中4-香豆酸、異亮氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、5’-單磷酸腺苷、9-羥基-10，12-十八二烯酸、蘋果酸、去氫大豆皂甙I、大豆皂苷Ba、山柰素-4’-甲醚、刺芒柄花素等56種物質(zhì)在黃漿水原液中相對含量顯著高于絮凝液。麥芽糖、香豆酸、可鐵林、膽堿磷酸、5’-S-甲硫腺苷、七葉苷、2’-O-甲基腺苷、2-羥基戊酸、苯并咪唑磺酸、3-（4-羥基苯基）乳酸等10種物質(zhì)在絮凝液中的相對含量顯著高于原液。絮凝時小分子化合物隨著大分子蛋白質(zhì)等有機物被絮凝劑絮凝析出，鑒定出85%的化合物含量顯著降低，隨著絮凝物質(zhì)析出后，部分化合物絮凝前后的相對含量發(fā)生了變化，所以出現(xiàn)了一小部分化合物在絮凝液中的含量大于黃漿水原液中的含量。鑒定出的物質(zhì)中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中大豆皂苷可以減少機體膽固醇，增強免疫力，抵抗癌細胞以及降血糖血脂等功效[26]。刺芒柄花素在改善婦女更年期癥狀和改善骨質(zhì)疏松等方面具有一定的作用，還具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性[27-28]。香豆酸具有抑制肥胖以及降血糖、降血脂等生物活性[29-30]。通過絮凝對黃漿水中小分子物質(zhì)進行富集，有利于黃漿水中小分子物質(zhì)進一步被利用，黃漿水中小分子營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，營養(yǎng)物質(zhì)的回收對于提高黃漿水的附加值具有重要的意義。

圖6 原液與絮凝液PCA得分圖Fig.6 PCA of yellow serofluid and supernatant

圖7 原液與絮凝液的層次聚類分析Fig.7 Heat map of yellow serofluid and supernatant

3 結(jié)論

本文在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化絮凝工藝中黃漿水可溶性固形物沉降率的最佳條件，確定了最佳工藝參數(shù)：殼聚糖添加量為0.54 mg/mL，海藻酸鈉添加量為0.24 mg/mL，pH為4.4，溫度為47 ℃，在此條件下的可溶性固形物沉降率為（46.26%±0.38%），得到的絮凝物質(zhì)冷凍干燥后蛋白質(zhì)純度為（63.21%±0.48%），沉降析出的蛋白質(zhì)占比黃漿水原液中的40.68%，BOD和COD去除率分別43%、40.95%。絮凝對黃漿水中的可溶性固形物具有較好的沉降作用，可以有效降低黃漿水環(huán)境污染。經(jīng)過絮凝后，黃漿水原液與絮凝液基于LC-QTOFMS方法分析，鑒定出其中的66種化合物的含量發(fā)生了顯著變化，代謝組學(xué)實驗結(jié)果表明黃漿水在絮凝過程中，不僅使蛋白質(zhì)及糖類等大分子物質(zhì)絮凝出來，同時對黃漿水中的一些具有生物活性功能的小分子物質(zhì)起到一定的富集作用，為黃漿水中活性小分子物質(zhì)的回收利用提供一定的參考。本研究對黃漿水的絮凝工藝進行了探索，研究結(jié)果對黃漿水的處理及工業(yè)化應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。