陳江艷，王維滔，董益陽, ，張繼川 ，胡孔新，馬 強

（1.北京化工大學生命科學與技術學院, 北京 100029；2.北京化工大學材料科學與工程學院, 北京100029；3.中國檢驗檢疫科學研究院衛(wèi)檢所, 北京100176；4.中國檢驗檢疫科學研究院工業(yè)品所, 北京100176）

菊糖，別名菊粉、土木香粉，是由D-呋喃果糖經β-2,1-糖苷鍵聚合而成的鏈狀多糖[1]，末端為葡萄糖殘基, 聚合度（DP）范圍為2～60, 平均在10～12左右[2]。菊糖在自然界中廣泛存在，主要以儲備多糖的形式存在于多種植物中[3]，如雪蓮果塊莖、婆羅門參、大麗花、菊芋、菊苣等[4]。菊糖不僅具有獨特的凝膠特性和類似脂肪的口感[5]，還具有降糖降脂、預防癌癥[6]、調節(jié)腸道環(huán)境、促進益生菌增殖、促進礦物質吸收[7]等多種生理功能[8-9]，在食品領域主要用于生產高純度果糖、低脂食品、膳食纖維、糕點和甜食面團的品質改良劑等[10]。

橡膠草，又名俄羅斯蒲公英，為菊科蒲公英屬大角蒲公英組多年生草本植物[11]，橡膠草不僅可以合成天然橡膠，還可以合成大量的碳水化合物菊糖[12]，主要儲存在韌皮部附近的根細胞液泡中[13]。目前國內外關于蒲公英橡膠草的研究主要集中在橡膠的提取、定量、結構表征等方面[14-15]，對于蒲公英橡膠草中菊糖的提取及結構表征的研究未見報道。工業(yè)上多采用熱水浸提法從菊芋、菊苣中提取菊糖[16-17]，關于蒲公英橡膠草菊糖的提取優(yōu)化研究較少，其分子質量及聚合度分布等研究也有待進一步深入。本研究擬對蒲公英橡膠草菊糖的提取及分離純化工藝進行研究，為蒲公英橡膠草的綜合開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲公英橡膠草 市售；考馬斯亮藍G-250 北京科華經緯科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉 北京化工廠；無水亞硫酸鈉 天津市光復科技發(fā)展有限公司；濃硫酸、苯酚、四水酒石酸鉀鈉、乙醇 均為分析純。

Autoflex speed MALDI-TOF 布魯克（北京）科技有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BT-25S型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SIGMA-3K15型離心機 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；DZF-150型真空干燥箱 鄭州長城科工貿有限公司；NanoDrop 2000C分光光度計 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菊糖提取工藝 蒲公英橡膠草根→洗凈→烘干→粉碎→超聲提取→離心→除蛋白→抽濾→脫色→旋蒸濃縮→醇沉（4～5次）→冷凍干燥→菊糖成品[18]。

將蒲公英橡膠草根洗凈后60 ℃烘干粉碎，取一定量的蒲公英橡膠草粉末于50 mL離心管中，加入一定量的去離子水，在一定的溫度、時間及功率下進行超聲提取，隨后在8000 r/min條件下離心5 min，取上清液進行純化（純化方法的選擇見1.2.6），純化后采用抽濾的方式除去沉淀，將所得的濾液采用大孔吸附樹脂進行脫色，控制流速為1 mL/min，收集流出液并定容后取樣在420 nm處測吸光度并計算其脫色效果[19]。將脫色后的菊糖提取液于60 ℃旋蒸濃縮至微量，然后加入4倍體積無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置20 min后離心（8000 r/min，10 min），沉淀留存，將上清液再次進行濃縮和醇沉[20]，反復沉淀4～5次直至無沉淀產生。將所得沉淀物在-20 ℃預凍12 h后，冷凍干燥約3 h得白色固體粉末狀菊糖成品。

1.2.2 菊糖單因素實驗 采用控制變量法，分別探究超聲功率、液料比、超聲溫度、超聲時間對菊糖提取率的影響[21]。

1.2.2.1 超聲功率對菊糖提取率的影響 選取溫度：60 ℃[22]，時間：20 min，液料比：20:1 mL/g，分別在功率：120、180、240、300 W進行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進行菊糖含量測定，探究超聲功率與菊糖提取率的關系。

1.2.2.2 液料比對菊糖提取率的影響 選取溫度：60 ℃，時間：20 min，功率：240 W，分別在液料比：10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g進行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進行菊糖含量測定，探究液料比與菊糖提取率的關系。

1.2.2.3 超聲溫度對菊糖提取率的影響 選取時間：20 min，功率：240 W，液料比：20:1 mL/g，分別在溫度：40、50、60、70、75 ℃進行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進行菊糖含量測定，探究超聲溫度與菊糖提取率的關系。

1.2.2.4 超聲時間對菊糖提取率的影響 選取超聲溫度：60 ℃，功率：240 W，液料比：20:1 mL/g，分別在超聲時間：10、20、30、40、50、60 min進行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進行菊糖含量測定，探究超聲時間與菊糖提取率的關系。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗 根據單因素實驗，分別以液料比（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）、超聲時間（D）為考察因素，設計了四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，全部試驗共計29組，其中設置為5組中心點重復實驗，用以估計試驗誤差，設計結果見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.4 菊糖提取率及含量的測定 采用苯酚硫酸法在490 nm波長處測定吸光度[23]，代入總糖標準曲線（回歸方程y=7.1083x-0.0253，R2=0.9987）計算出總糖含量；采用DNS法在540 nm波長處測定吸光度[24]，代入還原糖標準曲線（回歸方程y=1.4987x-0.0451，R2=0.9988）計算出還原糖含量；分別利用公式（1）和（2）計算出菊糖提取率和菊糖含量[16]。

1.2.5 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法，以牛血清白蛋白溶液為標準，以牛血清白蛋白溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，在595 nm處測定吸光度[25]，繪制標準曲線（y=5.1325x+0.1027，R2=0.9983），根據標曲計算出菊糖提取液中蛋白質含量，根據公式（3）計算出菊糖損失率，根據公式（4）計算蛋白質清除率。

1.2.6 菊糖純化方法的選擇

1.2.6.1 氫氧化鈣-磷酸法 工業(yè)上常用氫氧化鈣-磷酸法[26]進行純化，取一定量的菊糖粗提液，加入質量分數為10%的Ca（OH）2溶液，使溶液pH為12[27]，在80 ℃下，邊加熱邊攪拌20 min，再用20% H3PO4溶液調節(jié)pH為6，保溫10 min后，4000 r/min離心5 min，取上清液進行測量。

1.2.6.2 三氯乙酸法 取一定量的菊糖粗提液，加入12.5 mL 9%的三氯乙酸，攪拌20 min后，靜置30 min[28]，待溶液不再渾濁后，5000 r/min離心20 min，取上清液進行測量。

1.2.6.3 Sevage法 Sevage試劑的配制：氯仿：正丁醇=4:1[29]。

取一定量的菊糖粗提液，按Sevage試劑：樣液=1:5的比例加入Sevage試劑，劇烈搖晃25 min后離心去掉下層和乳白色的中間層，繼續(xù)對上清液進行處理，重復上述步驟5次，棄去沉淀后取上清液測量蛋白質含量及菊糖含量。

1.2.7 MALDI-TOF MS表征 采用WANG等[26]的方法，將菊糖成品溶于0.01 mol/L氯化鉀水溶液混合制成樣品，以DHB作為基質，基質用乙醇和水混合液（乙醇:水=1:1）配制成10 mg/mL，再將基質和樣品按1:1的比例混合進行MALDI-MS分析，在線性模式和反射模式下進行采集。

1.3 數據處理

實驗數據的測定均設置3個平行實驗，利用Origin 2017進 行 數 據 繪 制，利 用IBM SPSS Statistics 20對數據進行顯著性差異分析，利用Design Expert 10.0.7軟件進行響應面設計與分析。

2 結果與分析

2.1 蒲公英橡膠草菊糖的提取

2.1.1 蒲公英橡膠草菊糖提取單因素實驗

2.1.1.1 超聲功率對菊糖提取率的影響 由圖1可知，隨著超聲功率的增加，菊糖提取率先上升后下降，功率從180 W增加到240 W時，菊糖提取率顯著增加（P＜0.05），增加功率到300 W時提取率降低。原因是空化作用會隨著超聲功率的增強而增強，剪切效果也得到了增加，從而導致菊糖分子鏈的斷裂，使得菊糖提取率呈下降趨勢[20]。

圖1 超聲功率對蒲公英橡膠草菊糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on extractability of inulin

2.1.1.2 液料比對菊糖提取率的影響 由圖2可知，在10:1～30:1 mL/g的范圍內，菊糖提取率隨液料比的增加而顯著增加（P＜0.05），但液料比大于30:1 mL/g后，菊糖提取率隨液料比的減小緩慢降低。原因是液料比較小時，由于溶劑不夠，蒲公英橡膠草中的菊糖不能充分溶出，而液料比過大時，菊糖溶出則需要消耗更多時間和能量，因此菊糖提取率呈下降趨勢[20]。

圖2 液料比對蒲公英橡膠草菊糖提取率的影響Fig.2 Effect of solvent-solid ratio on extractability of inulin

2.1.1.3 超聲溫度對菊糖提取率的影響 由圖3可知，菊糖提取率隨溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，在50～60℃時，菊糖提取率顯著升高（P＜0.05），增加溫度到75℃時，菊糖提取率顯著降低（P＜0.05）。原因是隨著溫度的增加，樣品中的菊糖開始溶出，但溫度達到一定值時，菊糖已充分溶出，同時高溫會使菊糖發(fā)生分解，從而導致菊糖提取率的降低[30]。

圖3 超聲溫度對菊糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extractability of inulin

2.1.1.4 超聲時間的影響 由圖4可知，在10～30 min時，隨著超聲時間的增加，菊糖提取率也逐漸升高，超聲時間為30 min時，菊糖提取率達到最大，可能是因為超聲時間不足時，菊糖未能充分溶出，但時間達到60 min時，提取率顯著下降（P＜0.05），可能是由于提取時間過長，導致菊糖發(fā)生了分解，使菊糖的提取率降低[31]。

圖4 超聲時間對菊糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extractability of inulin

2.1.2 響應面試驗結果

2.1.2.1 Box-Behnken實驗設計與結果 利用Design Expert 10對蒲公英橡膠草中菊糖提取率進行響應面設計，響應面設計及結果見表2。其中1～20為析因實驗，21～25為5個中心實驗[32]。

對表2中數據進行回歸分析，得到回歸方程：菊糖提取率=-1.29+1.37×10-3A+2.94×10-3B+0.037C+2.06×10-3D+8.67×10-6AB+7.08×10-5AC-2.13×10-5AD-1.24×10-5BC-9.38×10-6BD+1.29×10-4CD-1.16×10-4A2-4.65×10-6B2-3.32×10-4C2-1.04×10-4D2。對實驗結果進行方差分析，結果見表3。

表2 響應面設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 模型方差分析Table 3 Variance analysis of the model

由表3可知，模型的F值為9.33，P＜0.0001，模型極顯著，失擬項誤差不顯著（P=0.2363＞0.05），說明模型對響應值擬合良好。模型決定系數R2=0.9032，R2Adj=0.8063,說明該模型擬合度良好。通過表中F值的大小可以得出各因素對蒲公英橡膠草菊糖提取率影響的大小為：C（超聲溫度）＞B（超聲功率）＞D（超聲時間）＞A（液料比）。

2.1.2.2 提取工藝的響應面優(yōu)化與分析 以提取率的回歸方程為依據，獲得了菊糖提取的響應面圖和等高線圖，通過控制其中兩個因素不變，探究另外兩個交互因素與提取率之間的關系。

分析圖5～圖10，可看出超聲功率、液料比、超聲溫度與超聲時間四因素間的響應曲面均為凸面且曲面均較為陡峭，說明四因素之間的交互作用對菊糖提取率的影響明顯。

圖5 超聲功率（B）和液料比（A）的交互作用Fig.5 The interaction of ultrasonic power and liquid-solid ratio

圖10 超聲時間（D）和超聲溫度（C）的交互作用Fig.10 The interaction of ultrasonic time and ultrasonic temperature

2.1.2.3 提取參數優(yōu)化與驗證實驗 通過Design Expert10軟件對數據進一步分析，得到模型的最優(yōu)參數為液料比（mL/g）=29.87:1，超聲功率229.25 W，提取溫度60.54 ℃，提取時間33.98 min，在此條件參數下，模型預測提取率為20.23%。為了實驗操作方便，將上述所得條件參數修正為液料比=30:1（mL/g）、功率：230 W、溫度：61 ℃、時間：34 min。在此條件下進行三次驗證實驗，得到實際提取率為20.14%±0.19%，與理論預測值非常接近，說明優(yōu)化后結果可靠。

圖6 超聲溫度（C）和液料比（A）的交互作用Fig.6 The interaction of ultrasonic temperature and liquid-solid ratio

圖7 超聲時間（D）和液料比（A）的交互作用Fig.7 The interaction of ultrasonic time and liquid-solid ratio

圖8 超聲溫度（C）和超聲功率（B）的交互作用Fig.8 The interaction of ultrasonic temperature and ultrasonic power

圖9 超聲時間（D）和超聲功率（B）的交互作用Fig.9 The interaction of ultrasonic time and ultrasonic power

2.2 蒲公英橡膠草菊糖的純化

采用三種方法脫蛋白的結果見表4，根據蛋白清除率及菊糖損失率進行比較分析，發(fā)現氫氧化鈣-磷酸法為最佳純化方法。

表4 菊糖脫蛋白所用的方法比較Table 4 Comparative study on methods of deproteinization of inulin

2.3 菊糖產品

將純化后的提取液通過大孔樹脂清除色素后[33]，檢測計算得出：脫色率：66.65%，菊糖損失率：16.83%，蛋白清除率：59.27%。將脫蛋白后的菊糖提取液經大孔吸附樹脂脫色、旋蒸濃縮后醇沉5次，再經過冷凍干燥得到白色固體粉末狀菊糖成品（圖11）。經檢測，成品中菊糖含量為80.8%。

圖11 菊糖Fig.11 Inulin

2.4 MALDI-TOF MS表征結果

分別對菊糖樣品進行了反射模式和線性模式采集，并對反射模式下的兩個分子量為1029和867的聚糖進行二級圖譜分析，見圖12～圖15，在所設條件下,可以檢測到聚合度范圍為2～30，初步確定單體的分子量為162，為一個果糖脫去一分子水的分子量，端基的分子量和為179，與菊糖分子結構信息相吻合[34]，如需進一步確定其結構組成及聚合度，需要對菊糖進行不同聚合度分離處理。

圖12 反射模式（900～4500）下菊糖的MALDI-TOF譜圖Fig.12 MALDI-TOF spectra of inulin in reflective mode（900～4500）

圖13 線性模式（2000～20000）下菊糖的MALDI-TOF譜圖Fig.13 MALDI-TOF spectra of inulin in linear model（2000～20000）

圖14 m/z=1029的二級質譜圖Fig.14 MS/MS of m/z=1029

圖15 m/z=867的二級質譜圖Fig.15 MS/MS of m/z=867

3 結論

以蒲公英橡膠草干根為菊糖提取原材料，采用超聲波法對蒲公英橡膠草根菊糖進行提??；不僅分析了蒲公英橡膠草菊糖的提取、提純等工藝過程，還討論分析了超聲功率、超聲時間、超聲溫度和液料比對菊糖提取率的影響?；趩我蛩貙嶒灥慕Y果，進行了響應面試驗，得到菊糖提取的最佳工藝條件：液料比（mL/g）=30:1、功率：230 W、溫度：61℃、時間：34 min，在此條件下，模型預測的菊糖提取率為20.23%，實際菊糖提取率為20.14%±0.19%，與預測值相比，相對誤差僅為0.45%，說明優(yōu)化結果可靠。經超聲提取后的菊糖粗提液里面還含有大量雜質，需經純化除去，因此，本研究分別采用了三氯乙酸法、Sevage法、氫氧化鈣-磷酸法對菊糖粗提液進行純化。根據純化后溶液的菊糖損失率及蛋白清除率進行比較，發(fā)現氫氧化鈣-磷酸法是最佳的純化方法，其蛋白清除率可達90.78%，菊糖損失率為26.44%。提取的成品中菊糖含量達80.8%，經MALDI-TOF MS進行分析，其雜質較少，在所設條件下，單體的分子量為162，端基的分子量和為179，聚合度在2～30。

本研究為蒲公英橡膠草的進一步綜合利用提供理論依據，為天然高分子聚合物相對分子質量的測定提供參考，并為菊糖進一步的結構分析奠定了基礎，具有一定的指導價值和實踐意義。