馮昌銀，鄭巧靈，黃建平，陳 瑚，連淵娥，楊映紅

胃癌是全球重大公共衛(wèi)生問題，我國是全球胃癌發(fā)病率最高的國家，其年齡標(biāo)準(zhǔn)化的5年存活率為27.4%[1]。中國每年胃癌病死例數(shù)占全球同期胃癌總病死例數(shù)的40%以上[2]。胃癌組織中基因突變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3]。載脂蛋白B mRNA編輯酶3(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3, APOBEC3)可以引起細(xì)胞基因組發(fā)生突變，從而引發(fā)腫瘤[4]。APOBEC3含有多個家族成員，其中的2個成員APOBEC3B(A3B)和APOBEC3G(A3G)被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高[5-8]。A3G在子宮頸癌[8]、卵巢漿液性癌[9]以及惡性黑色素瘤[10]中表達(dá)升高并與預(yù)后相關(guān)。然而，胃癌組織中A3G的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系尚未完全闡明。因此，本文應(yīng)用免疫組化檢測85例胃腺癌組織中A3G蛋白的表達(dá)情況，并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析A3G表達(dá)與胃癌臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年1～12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院收治的行胃癌根治性切除的病例。病例入組條件：(1)手術(shù)前均未行放、化療；(2)具有完整的臨床及隨訪資料；(3)病理診斷為腺癌(Lauren分型腸型)[11]。所有病例均由兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法重新閱片診斷，共85例符合入組條件。其中男性65例，女性20例；年齡27～84歲，中位年齡61歲；腫瘤位于賁門部22例，胃體25例，胃竇38例。腫瘤浸潤深度：黏膜或黏膜下層14例，肌層13例，漿膜下層24例，漿膜外34例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移4例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移81例。腫瘤TNM分期及臨床分期根據(jù)第8版AJCC標(biāo)準(zhǔn)[12]。每年通過電話或門診進(jìn)行隨訪，隨訪截至2020年6月或患者死亡。本實驗經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 胃癌組織中A3G轉(zhuǎn)錄水平分析用于在線工具基因表達(dá)譜動態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)(http: //gepia.cancer-pku.cn/index.html)的數(shù)據(jù)來自TCGA(https: //tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)。使用GEPIA分析胃癌組織及癌旁組織中A3G轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異。

1.3 免疫組化檢測胃癌組織中A3G蛋白水平免疫組化染色采用EliVision兩步法，所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，4 μm厚切片。經(jīng)脫蠟、梯度乙醇至水后，經(jīng)高溫高壓抗原修復(fù)，然后按照試劑說明書進(jìn)行染色。一抗A3G(ab75560)購自Abcam公司，按照1 ∶500稀釋。用PBS代替一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

A3G免疫組化結(jié)果判讀：A3G蛋白陽性為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)著色，按照染色強度和陽性范圍進(jìn)行綜合評分。(1)按染色強度評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。(2)陽性范圍評分：整張切片中的陽性腫瘤細(xì)胞/總的腫瘤細(xì)胞數(shù)。切片中腫瘤細(xì)胞染色強度評分乘以染色范圍評分為該病例的A3G評分。

1.4 胃癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞分析在鏡下評估HE切片中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的數(shù)量，按無浸潤、局灶性、輕度、中度和重度浸潤分別計為0～4五個等級。TIMER(https: //cistrome.shinyapps.io/ti-mer/)數(shù)據(jù)庫利用RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況。數(shù)據(jù)庫提供了6種免疫細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的浸潤情況。本實驗僅分析胃癌組織中B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞與A3G的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用構(gòu)成比描述，組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。采用Spearman相關(guān)分析A3G表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析胃癌中A3G mRNA的表達(dá)情況通過在線工具GEPIA分析TCGA芯片數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫總共收集胃癌組織樣本408例，癌旁組織樣本211例，結(jié)果顯示胃癌組織中A3G mRNA的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05，圖1)。

圖1 GEPIA在線分析A3G在TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌及癌旁組織中表達(dá)

2.2 胃癌中A3G蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)3G蛋白表達(dá)定位在胃腺癌腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，在不同的病例其陽性強度和范圍不同(圖2、3)。A3G表達(dá)評分范圍0～1.8，中位數(shù)0.9，評分≤0.9的病例42例(49.4%)，為A3G低表達(dá)組；評分>0.9的病例43例(50.6%)，為A3G高表達(dá)組。不同T、N分期胃癌的A3G表達(dá)存在差異，T3、T4期胃癌的A3G表達(dá)高于T1、T2，N2和N3期胃癌的A3G表達(dá)高于N1，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。而不同年齡、性別、腫瘤部位、M分期腫瘤組織中A3G的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

②③

2.3 胃癌中A3G表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系本組胃癌中A3G高表達(dá)組的5年生存率為46.5%，低表達(dá)組為71.4%，前者明顯低于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1，圖4)。

表1 胃癌不同臨床病理特征的A3G蛋白表達(dá)情況[n(%)]

圖4 胃癌組織中A3G蛋白不同表達(dá)水平患者的生存曲線

2.4 胃癌中A3G表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)系本實驗結(jié)果顯示，胃癌中A3G蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞存在相關(guān)性(r=0.327，P=0.002)。通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析表明，胃癌中A3G表達(dá)與腫瘤浸潤CD8+T淋巴細(xì)胞存在相關(guān)性(r=0.668，P<0.01，圖5)。

圖5 胃癌組織中A3G mRNA表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的關(guān)系

3 討論

APOBEC3基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的重要的致癌基因，它可以使正常細(xì)胞基因堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換而引起基因組不穩(wěn)定，從而誘發(fā)腫瘤[4,6]。APOBEC3基因位于22號染色體，它包括7個家族成員，分別是A3A、A3B、A3C、A3DE、A3F、A3G和A3H[13]。所有的成員均具有一個保守的氨基酸序列H-X-E-X23-28-P-CX2-4-C(X為任意氨基酸)組成的鋅指結(jié)構(gòu)功能域，該結(jié)構(gòu)域可以引發(fā)單鏈DNA中含有5′-TC模序堿基C→T的突變。A3A、A3B、A3C和A3H具有1個功能結(jié)構(gòu)域，而A3DE、A3F和A3G具有2個功能結(jié)構(gòu)域[14]。

A3B最早發(fā)現(xiàn)具有抗HIV感染和抵抗LINE-1轉(zhuǎn)座的作用[15-16]。隨后發(fā)現(xiàn)A3B在多個腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，特別是在乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌和子宮頸癌中，可以引發(fā)細(xì)胞基因組堿基突變[7]。A3B在卵巢漿液性癌[17]、食管鱗狀細(xì)胞癌[18]以及鼻咽癌[19]中表達(dá)亦升高，還可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥[12-13]。早期研究發(fā)現(xiàn)A3G在機體抗病毒過程中發(fā)揮重要作用，后來發(fā)現(xiàn)其在部分惡性腫瘤中也具有一定作用，但其在惡性腫瘤中的表達(dá)不如A3B廣泛[20]。2016年Leonard等[9]發(fā)現(xiàn)卵巢高級別漿液性癌中A3G表達(dá)升高，A3G是患者預(yù)后好的指標(biāo)。Iizuka等[8]發(fā)現(xiàn)A3G表達(dá)與子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，病變越重A3G表達(dá)水平越高。Han等[10]在皮膚黑色素瘤中研究發(fā)現(xiàn)A3G高表達(dá)與預(yù)后較好相關(guān)。目前，A3G在胃癌中的表達(dá)情況尚未闡明。

GEPIA是新近開發(fā)的基于TCGA數(shù)據(jù)庫的在線分析軟件，可以分析單個基因在不同癌癥中的表達(dá)情況。本實驗使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中A3G mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，但數(shù)據(jù)庫未能提供胃癌腫瘤亞型之間是否存在表達(dá)差異。本實驗采用免疫組化法檢測胃腺癌組織中A3G蛋白的水平。本文中僅列出了Lauren分型為腸型胃癌的病例，因為A3G在彌漫型胃腺癌中幾乎不表達(dá)(未列出數(shù)據(jù))，可能這兩型胃癌的發(fā)生機制不同[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)A3G蛋白在腸型腺癌中呈不同程度表達(dá)，A3G表達(dá)與腫瘤T、N分期及臨床分期相關(guān)，即腫瘤組織中A3G蛋白表達(dá)越高，腫瘤浸潤深度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多、臨床分期越晚。這可能由于A3G表達(dá)使腫瘤基因組不穩(wěn)定性增加，誘導(dǎo)了更多致癌基因、抑癌基因發(fā)生突變，其具體機制、信號通路有待于進(jìn)一步研究。多數(shù)研究認(rèn)為A3B表達(dá)與腫瘤預(yù)后差相關(guān)，但是已發(fā)表的研究認(rèn)為腫瘤組織A3G高表達(dá)反而患者預(yù)后好[8-10]。然而，本實驗發(fā)現(xiàn)腸型腺癌A3G高表達(dá)組患者的5年總生存期更短，是預(yù)后不良的指標(biāo)。這可能由于不同癌種中A3G的作用機制存在一定差異。

腫瘤細(xì)胞A3B表達(dá)增加會影響腫瘤周圍免疫微環(huán)境的變化[22]。A3G與A3B為同一家族成員，兩者在腫瘤中具有類似的作用。腫瘤細(xì)胞A3G高表達(dá)與免疫微環(huán)境是否存在一定的關(guān)系？TIMER數(shù)據(jù)庫提供了多個癌種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)。國內(nèi)學(xué)者Han等[10]使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析了惡性黑色素瘤中A3G表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)A3G表達(dá)與CD8+T淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)。本實驗采用相同的方法發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中A3G表達(dá)與CD8+T淋巴細(xì)胞亦呈正相關(guān)。因此，胃癌細(xì)胞A3G表達(dá)可能影響了腫瘤免疫微環(huán)境，這提示A3G可能會影響患者的免疫治療效果[23]。

APOBEC3家族成員在有些病毒相關(guān)的惡性腫瘤中表達(dá)升高，如子宮頸癌、鼻咽癌、肝癌等，APOBEC3升高可能與病毒感染誘導(dǎo)有關(guān)[8,19,24]。然而，有些腫瘤與病毒感染無關(guān)(如食管癌、卵巢癌)，腫瘤中也存在APOBEC3家族成員的表達(dá)升高，其具體機制還未完全闡明[9,17-18]。

總之，腸型胃腺癌組織中A3G高表達(dá)，其表達(dá)可能影響了腫瘤免疫微環(huán)境，是腸型胃腺癌患者預(yù)后差的指標(biāo)。在這一過程中A3G具體引起的哪些基因的改變還有待于更多的研究。