張?jiān)伱?，范麗昕，蔡永清，樸正?ài)，王海，周易，董華承，李萍

大連市第三人民醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連1160300

胃癌作為常見(jiàn)的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不盡相同，中國(guó)是胃癌高發(fā)地區(qū)之一。中國(guó)每年新發(fā)惡性腫瘤中，胃癌排名第2位，在消化道腫瘤中排名第1位。Lauren分型于1965年由Lau‐ren提出，2009年TOGA研究奠定了晚期胃癌的新型靶向治療，在此研究中發(fā)現(xiàn)Lauren分型與人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達(dá)有明顯的相關(guān)性，從而使Lauren分型再次受到臨床醫(yī)師的高度重視。Lau‐ren分型中腸型胃癌占大部分，但由于胃癌具有非常明顯的異質(zhì)性，Lauren分型無(wú)法區(qū)分不同生物學(xué)行為的腸型胃癌，減弱了其對(duì)預(yù)后的指導(dǎo)作用。因此，尋找腸型胃癌的預(yù)后生物標(biāo)志物一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。而聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)生物標(biāo)志物能更準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，有利于更好地評(píng)估腸型胃癌的生物學(xué)行為，對(duì)臨床治療方案的選擇具有重要意義。

腸型胃癌的發(fā)生是循序漸進(jìn)的，被認(rèn)為是由一系列癌前病變發(fā)展而來(lái)的，即Correa[1]提出的慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸化生→不典型增生→黏膜內(nèi)癌→侵襲性癌的轉(zhuǎn)化過(guò)程。Nanog、Sox2參與了腸上皮化生向腸型胃癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。三葉因子3（trefoil factor 3，TFF3）在Correa級(jí)聯(lián)反應(yīng)的各個(gè)階段表現(xiàn)不同。本研究通過(guò)檢測(cè)腸型胃癌患者術(shù)后Nanog、Sox2、TFF3的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)其表達(dá)情況與腸型胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年1月至2010年12月于大連市第三人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的腸型胃癌標(biāo)本60例。60例腸型胃癌患者的年齡為39～86歲，平均（63.13±9.43）歲；男43例，女17例。所有患者術(shù)前均未行放化療，TNM分期采用2010年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)。病灶位于賁門(mén)13例，位于胃體竇部47例；侵犯深度T1期8例，T2期9例，T3期26例，T4期17例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期14例，N1～3期46例；TNM分期Ⅰ期11例，Ⅱ期18例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例。所有患者均進(jìn)行電話(huà)隨訪或門(mén)診隨訪?？偵嫫跒榛颊叽_診時(shí)至死亡或末次隨訪時(shí)間，無(wú)病生存期為患者確診時(shí)至疾病進(jìn)展或末次隨訪時(shí)間。末次隨訪時(shí)間為2015年12月30日。

1.2 標(biāo)本處理

所有標(biāo)本均應(yīng)用10%中性福爾馬林固定，并進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋及切片，片厚4～5 μm。

1.3 試劑和方法

兔抗人Nanog單克隆抗體、兔抗人Sox2單克隆抗體、鼠抗人TFF3單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司；一抗試劑稀釋濃度：Nanog 1/100，Sox2 1/100，TFF3 1/100。一抗試劑盒、二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH值為7.4）代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。免疫組化染色采用SP法，染色步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 免疫組化染色判定方法

細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（400倍）。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。采用半定量積分法判定結(jié)果，即將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分的乘積定為每1例染色的綜合評(píng)分，0～2分為（－），3～5分為（+），6～9分為（++），10～12分為（+++）。評(píng)分≤2分為低表達(dá)，評(píng)分＞2分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan‐Meier法進(jìn)行生存曲線(xiàn)分析，組間比較采用Log‐rank檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nanog、Sox 2、TFF 3在腸型胃癌中的表達(dá)

60例腸型胃癌患者的Nanog、Sox2主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，TFF3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。Nanog高表達(dá)者 38例（63.3%），TFF3高表達(dá)者 33例（55.0%），Sox2低表達(dá)者35例（58.3%）。（圖1）

圖1 腸型胃癌患者的Nanog、Sox 2、TFF 3免疫組化圖片（SP染色，×400）

2.2 Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，Nanog、TFF3、Sox2的表達(dá)情況與腸型胃癌患者的腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與腸型胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位無(wú)關(guān)（P＞0.05）。（表1）

2.3 Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者無(wú)病生存期和總生存期的關(guān)系

Nanog低表達(dá)腸型胃癌患者的無(wú)病生存期和總生存期長(zhǎng)于Nanog高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sox2高表達(dá)腸型胃癌患者的無(wú)病生存期和總生存期長(zhǎng)于Sox2低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TFF3低表達(dá)腸型胃癌患者的無(wú)病生存期和總生存期長(zhǎng)于TFF3高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、圖3）。

2.4 Nanog、Sox 2、TFF 3聯(lián)合表達(dá)與腸型胃癌患者無(wú)病生存期和總生存期的關(guān)系

多因素分析結(jié)果顯示，同時(shí)具有Nanog低表達(dá)、TFF3低表達(dá)、Sox2高表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最佳，同時(shí)具有Nanog高表達(dá)、TFF3高表達(dá)、Sox2低表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最差。（表2、表3）

3 討論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，如何將遺傳學(xué)信息用于指導(dǎo)診斷或治療備受關(guān)注。由于胃癌具有非常明顯的異質(zhì)性，相同臨床分期的腸型胃癌存在明顯不同的預(yù)后狀態(tài)，使得根據(jù)臨床分期進(jìn)行治療存在很多不足。因此尋找與患者預(yù)后生存相關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)腸型胃癌更細(xì)致的分型、預(yù)后判斷、隨訪以及潛在改變腸型胃癌患者的治療方式并提出個(gè)體化的診療具有重要意義。

表1 Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3.1 Nanog在腸型胃癌組織中的表達(dá)

Nanog為ANTP類(lèi)NK家族基因，定位于人染色體12p13區(qū)，作為胚胎干細(xì)胞維持其多潛能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌、精原細(xì)胞瘤、腸癌、宮頸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[2‐5]。本研究結(jié)果顯示，Nanog的表達(dá)情況與腸型胃癌患者的腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），腫瘤浸潤(rùn)深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚，Nanog表達(dá)水平越高。而腫瘤浸潤(rùn)深度深、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、TNM分期晚皆為腫瘤的惡性表型，提示Nanog可能在腸型胃癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用。說(shuō)明Nanog可以作為判斷腸型胃癌預(yù)后的指標(biāo)。

3.2 TFF 3在腸型胃癌組織中的表達(dá)

TFF3屬于三葉因子家族，是由胃腸道黏液分泌上皮合成和分泌的一組具有特定三葉結(jié)構(gòu)的小分子多肽，主要功能是維持胃腸道黏膜的完整性和促進(jìn)上皮修復(fù)，此外還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤侵襲的功能[6]。本研究結(jié)果顯示，在腸型胃癌組織標(biāo)本中，TFF3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、腫瘤部位無(wú)關(guān)（P＞0.05）。TFF3高表達(dá)腸型胃癌患者的無(wú)病生存期和總生存期短于TFF3低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明TFF3可以作為預(yù)測(cè)腸型胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

3.3 Sox 2在腸型胃癌組織中的表達(dá)

圖2 Nanog、Sox 2、TFF 3高表達(dá)與低表達(dá)腸型胃癌患者的無(wú)病生存曲線(xiàn)

圖3 Nanog、Sox 2、TFF 3高表達(dá)與低表達(dá)腸型胃癌患者的生存曲線(xiàn)

Sox2是Sox家族成員之一，位于3號(hào)染色體q26.3‐q27[7]。通過(guò)HMG結(jié)構(gòu)域識(shí)別靶基因，特異性結(jié)合DNA序列，廣泛參與調(diào)控胚胎發(fā)育，尤其是在維持胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和多能性上具有重要作用。它可能通過(guò)ⅠL‐4/STAR6信號(hào)通路維持胃細(xì)胞分化的方向，使細(xì)胞分化成腸化生細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，在腸型胃癌中，腫瘤惡性程度越高，Sox2表達(dá)水平越低；Sox2高表達(dá)患者的無(wú)病生存期和總生存期長(zhǎng)于Sox2低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其機(jī)制可能是Sox2可抑制胎盤(pán)特異蛋白1的表達(dá)，使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力、遷移能力和侵襲能力降低，細(xì)胞周期阻滯在G1～S期，降低細(xì)胞的增殖能力，在胃癌中起到一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。推測(cè)Sox2蛋白表達(dá)下降或缺失時(shí)，胃癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[8]。

表2 腸型胃癌患者Nanog、Sox 2、TFF 3聯(lián)合表達(dá)的無(wú)病生存期分析

表3 腸型胃癌患者Nanog、Sox 2、TFF 3聯(lián)合表達(dá)的總生存期分析

3.4 腸型胃癌組織中Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

腸型胃癌與癌前病變有關(guān)，Nanog、Sox2、TFF3參與了腸上皮化生向腸型胃癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。本研究進(jìn)一步分析Nanog、Sox2、TFF3聯(lián)合表達(dá)與腸型胃癌的關(guān)系。結(jié)果顯示，同時(shí)具有Nanog低表達(dá)、TFF3低表達(dá)、Sox2高表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最佳，同時(shí)具有Nanog高表達(dá)、TFF3高表達(dá)、Sox2低表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最差。提示聯(lián)合檢測(cè)Nanog、Sox2、TFF3在腸型胃癌中的表達(dá)較單一指標(biāo)更能夠準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，有利于更好地評(píng)估腸型胃癌的生物學(xué)行為。

綜上所述，Nanog、Sox2、TFF3可以作為腸型胃癌患者獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物，聯(lián)合檢測(cè)更利于判斷腸型胃癌患者預(yù)后，可以更好地為腸型胃癌的預(yù)后評(píng)估及臨床治療提供依據(jù)。

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