李智宇

黃河科技學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河南省鄭州市 450000

舒芬太尼是一種強(qiáng)效的鎮(zhèn)痛藥，屬于阿片類(lèi)的鎮(zhèn)痛藥，是臨床常用的一種麻醉藥物[1]。舒芬太尼在阿片類(lèi)藥物中鎮(zhèn)痛效應(yīng)最強(qiáng)，盡管該藥在臨床上使用是安全的，但長(zhǎng)期使用此類(lèi)藥物后，機(jī)體會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，而為了減少疼痛，不得不加大用藥劑量以達(dá)到與長(zhǎng)期使用前類(lèi)似的治療效果，從而影響患者的疼痛控制及生活質(zhì)量。近年來(lái)有研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化及痛覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中具有重要作用，可預(yù)防急性阿片類(lèi)藥物耐受的發(fā)生[2-3]。NMDA受體是離子型谷氨酸受體的一個(gè)亞型，在細(xì)胞增殖凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)及神經(jīng)性疾病(如精神性疼痛)等機(jī)制中起重要作用。NMDA受體是由基本亞基(NR1)和調(diào)節(jié)亞基(NR2)組成的異四聚體或異五聚體[4]。而NMDA受體2B(NMDA receptor2B，NR2B)亞基是NR參與疼痛調(diào)節(jié)的主要亞基。有研究表明，NR2B過(guò)度表達(dá)在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持方面起關(guān)鍵作用[5]。因此，本研究主要通過(guò)建立舒芬太尼耐受SD大鼠模型，分析脊髓背角NR2B亞基表達(dá)水平情況，研究舒芬太尼耐受形成的作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取40只SD成年雄性大鼠，SPF級(jí)(清潔動(dòng)物)，大鼠體重為180～200g，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每只分籠圈養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為研究組與對(duì)照組，每組20只。

1.2 兩組SD大鼠模型構(gòu)建 對(duì)照組給予皮下注射0.9%氯化鈉溶液(生產(chǎn)廠家：國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，規(guī)格：10ml×0.9g×5支，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20044024)。2次/d，分別于8:00AM及20:00PM進(jìn)行，共注射10d。研究組給予皮下注射舒芬太尼(生產(chǎn)廠家：宜昌人福藥業(yè)有限公司，規(guī)格：5ml∶250μg×5支，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20054256)建立舒芬太尼耐受SD大鼠模型。2次/d，分別于8:00AM及20:00PM進(jìn)行，注射劑量為80μg/kg，共注射10d。

1.3 機(jī)械性刺激痛閾 分別于皮下注射前及皮下注射后第5天及第10天測(cè)量每只SD大鼠的機(jī)械性刺激痛閾。實(shí)驗(yàn)前將SD大鼠置于有機(jī)玻璃箱內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境15min，使用弗雷纖維絲(VonFrey纖維)刺激SD大鼠后肢足底至SD大鼠后爪出現(xiàn)縮足反應(yīng)為止，力量由輕至重，每只連續(xù)測(cè)量3次，每次持續(xù)3s，測(cè)量時(shí)間間隔10min，取其平均值記錄作為每只SD大鼠的機(jī)械性刺激痛閾值。

1.4 熱縮足反應(yīng)潛伏期 分別于皮下注射前及皮下注射后第5天及第10天測(cè)量每只SD大鼠的熱縮足反應(yīng)潛伏期。實(shí)驗(yàn)前將SD大鼠置于輻射熱測(cè)痛儀玻璃箱內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境15min，調(diào)節(jié)光源與玻璃箱距離，觀察SD大鼠的縮足反應(yīng)，每只連續(xù)測(cè)量3次，每次持續(xù)20s，測(cè)量時(shí)間間隔5min，取其平均值記錄作為每只SD大鼠的熱縮足反應(yīng)潛伏期值。

1.5 脊髓背角NR2B亞基水平 兩組SD大鼠分別于皮下注射后第5天及第10天經(jīng)上述檢測(cè)后各取10只SD大鼠處死，取SD大鼠左側(cè)脊髓背角(L4～L5)組織后提取總蛋白，將40μg蛋白加入樣本中水煮，使其變性，完成后將其加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠中電泳，將其轉(zhuǎn)膜至醋酸纖維素膜封閉2h。將NR2B和β-actin兔抗鼠多克隆抗體置于4℃環(huán)境下孵育，二抗常溫孵育60min，利用化學(xué)發(fā)光試劑。與昏暗光線下曝光膠片，將其浸泡于顯影液和定影液中。掃描條帶吸光度，并對(duì)比蛋白相對(duì)含量。

1.6 脊髓背角NR2B mRNA水平 兩組SD大鼠分別于皮下注射后第5天及第10天經(jīng)上述檢測(cè)后各取10只SD大鼠處死，取SD大鼠左側(cè)脊髓背角(L4～L5)組織后提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的cDNA模板擴(kuò)增。NR2B mRNA基因引物：上游5’-TGGACAATTACYCCYCGACG-3’,下游5’-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3’；β-actin基因引物：上游5’-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3’，下游5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’。條件設(shè)置：95℃5min，94℃30s，50～60℃退火30s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)。完成后將其置入瓊脂糖凝膠中電泳，掃描條帶吸光度，并對(duì)比 mRNA相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 兩組SD大鼠注射前后機(jī)械性刺激痛閾值對(duì)比 對(duì)照組注射前后機(jī)械性刺激痛閾值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；注射后第5天和第10天研究組機(jī)械性刺激痛閾值高于對(duì)照組(P<0.05)；研究組注射后第5天和第10天機(jī)械性刺激痛閾值均高于注射前，且注射后第5天高于注射后第10天(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 兩組SD大鼠注射前后熱縮足反應(yīng)潛伏期值對(duì)比 對(duì)照組注射前后熱縮足反應(yīng)潛伏期值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；注射后第5天和第10天研究組熱縮足反應(yīng)潛伏期值高于對(duì)照組(P<0.05)；研究組注射后第5天和第10天熱縮足反應(yīng)潛伏期值均高于注射前，且注射后第5天高于注射后第10天(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組SD大鼠注射前后熱縮足反應(yīng)潛伏期值比較

2.3 兩組SD大鼠脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平對(duì)比 研究組注射后第5天和第10天脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平均高于對(duì)照組，且研究組注射后第5天脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平均低于注射后第10天(P<0.05)；而對(duì)照組注射后第5天和第10天脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組SD大鼠脊髓背角NR2B亞基及mRNA水平比較

3 討論

舒芬太尼是芬太尼的衍生物，主要作用于μ阿片受體，阿片類(lèi)物質(zhì)與阿片受體結(jié)合能有效改善患者疼痛[6]。有研究表示，在臨床醫(yī)療及外科手術(shù)中，阿片類(lèi)藥物對(duì)抑制患者急慢性疼痛具有重要意義[7]。雖然舒芬太尼在緩解疼痛方面效果顯著，無(wú)“天花板效應(yīng)”，可持續(xù)增加劑量直至無(wú)痛，能讓患者“忘記疼痛”，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生耐藥，降低鎮(zhèn)痛作用。近年來(lái)諸多學(xué)者致力于研究阿片類(lèi)藥物的耐受機(jī)制，但有關(guān)舒芬太尼耐受研究較小。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NMDA受體拮抗劑在抑制阿片類(lèi)藥物耐受的方面效果顯著[8]。NR2B亞基是脊髓背角NMDA受體的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和功能特征決定了NR2B參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展的病理過(guò)程[9]。因此，解析脊髓背角NMDA受體NR2B亞基對(duì)舒芬太尼耐受形成的作用，對(duì)臨床減少或避免舒芬太尼耐受，提高鎮(zhèn)痛效果十分重要。

目前臨床認(rèn)為，藥物耐受的基礎(chǔ)是機(jī)體長(zhǎng)期使用或解除依賴(lài)性藥物產(chǎn)生的代償性適應(yīng)[10]。而多數(shù)依賴(lài)性藥物都能改變NMDA受體的表達(dá)和功能。NR2B亞基作為NMDA受體的重要亞基之一，在藥物誘導(dǎo)精神依賴(lài)過(guò)程中起重要作用[11]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMDA受體激活后可促進(jìn)NO的合成，導(dǎo)致SD大鼠機(jī)械性刺激痛閾值降低[12]。本研究中，在研究組SD大鼠對(duì)舒芬太尼產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用和痛覺(jué)過(guò)敏后持續(xù)給予舒芬太尼，其機(jī)械性刺激痛閾值較對(duì)照組顯著增高，說(shuō)明舒芬太尼對(duì)SD大鼠產(chǎn)生了鎮(zhèn)痛作用，且隨著連續(xù)皮下注射舒芬太尼的次數(shù)增加，SD大鼠對(duì)舒芬太尼產(chǎn)生了耐藥，與既往多數(shù)研究結(jié)果一致，提示NR2B亞基與舒芬太尼耐受形成密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)注射后第5天和第10天SD大鼠脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平升高，提示NR2B亞基表達(dá)水平與舒芬太尼耐受密切相關(guān)，說(shuō)明舒芬太尼誘導(dǎo)大鼠耐受形成主要是通過(guò)促進(jìn)脊髓背角NR2B 亞基表達(dá)水平增加，進(jìn)而產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏。本次研究未探討如何緩解舒芬太尼耐受形成，但既往有研究表示，可將NR2B亞基作為舒芬太尼耐受形成的治療靶點(diǎn)，為臨床改善急慢性疼痛提供方向[13]。

綜上所述，舒芬太尼耐受形成與脊髓背角NMDA受體NR2B亞基表達(dá)水平升高有關(guān)，可將NR2B亞基作為舒芬太尼耐受形成的治療靶點(diǎn)，為臨床改善急慢性疼痛提供方向。