趙秀榮,侯紹郅,皇甫通,何 杰,李 剛,馬成俊,石 慧,王振華

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,線粒體與健康衰老研究中心,山東 煙臺(tái) 264005)

機(jī)體內(nèi)氧分子經(jīng)單電子逐步還原生成的活性氧(ROS)可作為初始信號(hào),激活非特異性免疫系統(tǒng),在組織損傷修復(fù)及殺滅病原體過程中發(fā)揮重要作用[1]。但劇烈炎癥反應(yīng)生成的過量ROS可致各組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,被認(rèn)為是機(jī)體衰老和老年性疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)[2]。線粒體作為真核細(xì)胞氧代謝的關(guān)鍵細(xì)胞器,在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等命運(yùn)中發(fā)揮重要作用,源于線粒體ROS在維持其穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要[3]。

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作為toll樣受體4(TLR4)細(xì)胞外主要配體,與TLR4結(jié)合啟動(dòng)免疫應(yīng)答,介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化,并激活其在胞漿內(nèi)的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑:NF-κB和MAPKs等,導(dǎo)致大量細(xì)胞炎癥因子(TNF-α、NO)、ROS以及RNS的過量產(chǎn)生[4-5]。ROS的產(chǎn)生主要發(fā)生在線粒體,LPS誘導(dǎo)免疫細(xì)胞刺激TNF-α的產(chǎn)生進(jìn)而驅(qū)動(dòng)線粒體ROS的生成,氧化劑也參與了炎癥性線粒體損傷[6]。線粒體DNA位于產(chǎn)生ROS的電子傳遞復(fù)合物附近,由于缺乏保護(hù)性組蛋白,易受到外界氧化應(yīng)激的影響而發(fā)生損傷[7],進(jìn)而干擾線粒體轉(zhuǎn)錄和OXPHOS蛋白合成,損害線粒體呼吸能力,導(dǎo)致線粒體基因表達(dá)和功能的改變,進(jìn)一步影響線粒體生物發(fā)生過程[8]。

異甘草素(Isoliquiritigenin,ISL,結(jié)構(gòu)式如圖1)是傳統(tǒng)中藥甘草中所含的一種查爾酮類化合物,具有優(yōu)異的抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性[9-11],但其確切的生物學(xué)機(jī)制仍待探究。本研究采用LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的炎性模型,考察了ISL的抗炎作用,探討了ISL抗炎作用與維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)系,為甘草傳統(tǒng)應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

圖1 ISL結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of ISL

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞系由煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng),高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、10% FBS血清(Gibco)、5 % CO2在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋電器集團(tuán));生物超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);倒置相差顯微鏡(香港Motic公司);多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices Corporation);流式細(xì)胞儀(杭州艾森公司);Micro 21R高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific Inc);數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市科興儀器廠);電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);MH-2微孔板孵育振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);蛋白電泳儀器(美國 BIO-RAD公司);Tanon 5500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);7500fastReal-TimePCR(Applied Biosystems)。

1.3 材料與試劑

ISL、LPS、MTT粉末(美國Sigma公司);蛋白酶抑制劑(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA);BCA蛋白定量試劑盒、NAC、NO試劑盒、TNF-α測定試劑盒(上海Beyotime公司);ATP測定試劑盒(上海Beyotime公司);mito-TEMPO、mito-SOX、mito-Tracker Green、DCFH-DA探針(美國 Sigma 公司);Trizol試劑(Ambion/Invitrogen);M-MLV Reverse Transcriptase(Promega);M-MLV RT 5×Buffer(Promega);SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKara Bio INC);β-actin一抗、iNOS一抗、Drp1一抗、Mfn1/2一抗、PGC-1α一抗、NRF1一抗和Tfam一抗(美國CST公司);HRP耦聯(lián)山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz Biotechnology公司)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

2.1.1 ISL干預(yù)實(shí)驗(yàn) 設(shè)置三組:對(duì)照組(含有等量的溶劑對(duì)照)、模型組(LPS處理)、ISL組(5,10,20 μmol/L ISL處理)。

2.1.2 抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn) 設(shè)置五組:對(duì)照組(含有等量的溶劑對(duì)照)、模型組(LPS處理)、ISL組(5,10,20 μmol/L ISL處理)、抑制劑處理組(包括NAC、Mito-tempo、Cccp 抑制劑)、抑制劑與ISL聯(lián)用組(三種抑制劑分別與5,10,20 μmol/L ISL共處理,抑制劑提前30 min預(yù)處理)。

2.2 細(xì)胞活力測定

細(xì)胞按照8×104個(gè)/mL每孔100 μL接種于96孔板,5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入不同濃度含ISL的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。處理結(jié)束后,棄原培養(yǎng)液,每孔加入100 μL含10% MTT(5 mg/mL)DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,然后小心吸棄含MTT體系,每孔加入150 μL DMSO溶液,水平震蕩15 min,酶標(biāo)儀570 nm波長下測定吸光度A570。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A570/對(duì)照組A570×100%。

2.3 Griess法測定NO濃度

細(xì)胞按照1×106個(gè)/mL每孔100 μL接種于96孔板,5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后,按“2.1.1”方法分組處理細(xì)胞,孵育24 h。Griess法測定細(xì)胞上清液NO濃度,吸取50 μL/孔細(xì)胞上清液于96孔板中,然后分別加入等體積的Griess A和B,室溫孵育10 min,540 nm處測定吸光度,根據(jù)NaNO2的連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品中的NO濃度。

2.4 ELISA法測定TNF-α濃度

細(xì)胞按照1×106個(gè)/mL每孔100 μL接種于96孔板,5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后,按“2.1.1”方法分組處理細(xì)胞,孵育12 h后收集細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒測定細(xì)胞上清液TNF-α濃度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品中TNF-α濃度。

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS以及線粒體源ROS的檢測

細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于12孔板,37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,按“2.1.2”方法分組處理細(xì)胞,處理結(jié)束后,吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗一遍。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)ROS的測定,加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針,37 ℃黑暗條件孵育30 min,吸棄探針,預(yù)熱的PBS清洗兩遍,500 μL PBS重懸細(xì)胞,放入冰盒避光,利用流式細(xì)胞儀在470/530 nm下測定胞內(nèi)ROS水平。對(duì)于線粒體源ROS的測定,5 μmol/L Mito-SOX熒光探針代替DCFH-DA熒光探針,流式細(xì)胞儀在510/580 nm下測定線粒體源ROS水平。

2.6 細(xì)胞線粒體膜電勢(MPP)的測定

細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于12孔板,37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,按“2.1.2”方法分組處理細(xì)胞,孵育24 h。處理結(jié)束后,吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗一遍,加入10 μmol/L JC-1熒光探針,37 ℃在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)30 min,然后預(yù)溫的PBS洗滌兩次,并懸于PBS中,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析線粒體膜電勢。

2.7 細(xì)胞線粒體質(zhì)量數(shù)以及ATP的測定

細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于12孔板,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,按“2.1.1”方法分組處理細(xì)胞,孵育24 h,處理結(jié)束后,加入150 nmol/L Mito-Tracker Green熒光探針在37 ℃黑暗條件下孵育30 min,然后用預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞兩次,將細(xì)胞懸浮于PBS中,并在490/516 nm下使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定分析線粒體質(zhì)量數(shù)。對(duì)于ATP的測定,使用基于熒光素酶的熒光增強(qiáng)ATP檢測試劑盒測定RAW 264.7巨噬細(xì)胞中ATP含量,用冰冷的PBS清洗細(xì)胞,加入100 μL冰冷的ATP裂解液,裂解完全后,12 000×g,4 ℃離心5 min,上清用于多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行ATP含量的測定。

2.8 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)檢測

細(xì)胞按照3×105個(gè)/孔接種于6孔板,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,按“2.1.1”方法分組處理細(xì)胞,孵育24 h。處理結(jié)束后,用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍,并用含有蛋白酶抑制劑混合物的緩沖液裂解(RAPA/PMSF=100/1,PMSF母液濃度為100 μmol/L)充分裂解后,12 000×g,4 ℃離心15 min。然后用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)提取物并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含有5%無脂牛奶的TBS-T緩沖液封閉PVDF膜90 min,并在4 ℃下與一抗孵育搖床過夜。用TBST洗滌3次后,將膜與二抗在室溫下溫育1 h,TBST洗滌3次,然后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑拍攝圖像,蛋白條帶利用Image J處理進(jìn)行定量分析。

2.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的測定

細(xì)胞按照3×105個(gè)/孔接種于6孔板,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,按“2.1.1”方法分組處理細(xì)胞,孵育12 h。處理結(jié)束后,Trizol法提取細(xì)胞總RNA:離心機(jī)預(yù)冷準(zhǔn)備;準(zhǔn)備好相關(guān)無RNA酶試劑和實(shí)驗(yàn)耗材;超凈臺(tái)面用酒精和DEPC水擦拭。去除細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS清洗兩遍,加入500 μL Trizol,吹打至EP管中,上下混勻,室溫放置5 min。加入100 μL氯仿,混勻,室溫放置5 min,12000×g,4 ℃離心15 min,分三層,RNA在上層清液中。轉(zhuǎn)移到新的EP管中。加入與上清等體積的異丙醇,輕輕混勻,室溫靜置10 min。12 000×g,4 ℃離心10 min傾倒異丙醇。75%乙醇洗滌沉淀。離心去除上清,超凈臺(tái)中中風(fēng)速吹風(fēng)晾干。DEPC水溶解總RNA,放在冰盒上待用,長時(shí)間保存需要轉(zhuǎn)移到-80°C冰箱中。

(1)cDNA的合成:RNA、oligodT、DEPC水比例混勻,PCR儀上72 ℃、3 min循環(huán)一次。在上述基礎(chǔ)上,按比例加入Buffer、dNTP、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、DEPC水42 ℃、90 min循環(huán)一次;70 ℃、15 min循環(huán)一次。即得cDNA。

(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:目的基因的引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequence of primers for quantitative real-time PCR

配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:10 μL SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ+1 μL primers+1μL cDNA模板+0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ+6.6 μL DEPC水。將上述反應(yīng)液放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件如表2所示。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序Tab.2 Reaction program for quantitative real-time PCR

(3)相對(duì)定量分析:目的基因的表達(dá)采用比較Ct值,用內(nèi)參基因β-actin來校正差異,變化的倍數(shù)量為2-ΔΔCt。計(jì)算公式為:變化倍數(shù)=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)藥物處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 ISL對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活的影響

為探究ISL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7存活的影響,不同濃度的ISL處理24 h后(圖2),ISL濃度依賴性的抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)。結(jié)果顯示,在ISL低于20 μmol/L的濃度處理下,細(xì)胞存活率沒有顯著性變化,因此,ISL在低于20 μmol/L濃度時(shí)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的增殖沒有明顯的抑制作用,故選用5～20 μmol/L濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與對(duì)照組相比, *P < 0.05, **P<0.01。圖2 ISL對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of ISL on the proliferation of RAW 264.7 cells

3.2 ISL對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO和TNF-α釋放的影響

如圖3結(jié)果顯示,ISL在5、10和20 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NO和TNF-α的過量產(chǎn)生并呈劑量依賴關(guān)系,同時(shí),20 μmol/L ISL對(duì)NO和TNF-α的過量產(chǎn)生有較好的抑制作用,可以使它們大致恢復(fù)至空白對(duì)照組水平。

與對(duì)照組相比,**P < 0.01;與模型組相比,##P < 0.01。圖3 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO和TNF-α的抑制作用Fig.3 Isoliquiritigenin inhibited the release of NO and TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.3 ISL對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響

如圖4結(jié)果顯示,對(duì)照組RAW 264.7細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)量較少,經(jīng)LPS刺激24 h后,其表達(dá)量顯著增加,而20 μmol/L ISL對(duì)iNOS的過量表達(dá)具有顯著抑制作用,可以使iNOS蛋白水平大致恢復(fù)至空白對(duì)照組水平,從而發(fā)揮抗炎活性。

與對(duì)照組相比,**P < 0.01;與模型組相比,##P < 0.01。圖4 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ISL on the protein expression of iNOS in LPSinduced RAW 264.7 cells

3.4 ISL對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞胞內(nèi)ROS以及線粒體源ROS水平的影響

如圖5(a),(b)結(jié)果所示,與對(duì)照組相比,模型組胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度(P< 0.01)顯著提高,表明LPS能上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS生成。陽性對(duì)照組(10 mmol/L NAC)能夠顯著降低由LPS引起胞內(nèi)ROS的增加,并且ISL預(yù)處理組可以顯著降低LPS引起的ROS增加。圖5(c),(d)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組中Mito-SOX熒光強(qiáng)度(P<0.01)顯著升高,表明LPS可以上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞中線粒體源ROS的生成。陽性對(duì)照組(10 μmol/L Mito-tempo)能夠顯著降低LPS引起的線粒體源ROS的增加,而20 μmol/L ISL預(yù)處理組可以顯著降低由LPS引起的線粒體源ROS的增加。

與對(duì)照組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05;##P<0.01。圖5 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞胞內(nèi)以及線粒體源ROS 的影響Fig.5 Effect of ISL on intracellular or mitochondrial ROS levels in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.5 ISL對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體膜電勢以及ATP產(chǎn)生的影響

圖6(a,b)結(jié)果顯示,細(xì)胞經(jīng)LPS處理后,RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電勢與對(duì)照組相比顯著降低。而ISL預(yù)處理后,RAW 264.7細(xì)胞線粒體膜電勢有所改善。其中10和20 μmol/L的ISL預(yù)處理后,與模型組相比,細(xì)胞線粒體膜電勢具有顯著性差異。圖6(c)結(jié)果顯示,經(jīng)LPS處理后,RAW 264.7細(xì)胞中線粒體產(chǎn)生ATP的能力與對(duì)照組相比顯著降低。ISL預(yù)處理后,ATP的產(chǎn)生有所增加,線粒體功能可恢復(fù)至空白組水平,用5和10 μmol/L ISL預(yù)處理后,與模型組相比,ATP的產(chǎn)生無顯著性差異。然而,用20 μmol/L的ISL預(yù)處理后,與模型組相比,ATP的含量顯著增加,線粒體功能恢復(fù)至與對(duì)照組相似水平。

3.6 ISL對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體質(zhì)量數(shù)的影響

圖7(a,b)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組中Mito-Tracker熒光強(qiáng)度(P< 0.01)顯著升高,表明LPS可以上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞中線粒體質(zhì)量數(shù)水平,此結(jié)果與前面LPS上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞中ROS水平相對(duì)應(yīng),而ISL預(yù)處理組可以顯著降低由LPS引起的線粒體質(zhì)量數(shù)的增加。

與對(duì)照組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05;##P<0.01。圖6 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體功能的影響Fig.6 Effect of ISL on mitochondrial function in LPS-induced RAW 264.7 cells

與對(duì)照組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05;##P<0.01。圖7 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體質(zhì)量數(shù)的影響Fig.7 Effect of ISL on mitochondrial mass in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.7 ISL處理對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖8結(jié)果顯示,細(xì)胞經(jīng)LPS處理后,RAW264.7細(xì)胞中PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低,經(jīng)不同濃度的ISL預(yù)處理后,PGC-1α和Tfam的表達(dá)水平與模型組相比顯著升高,而NRF1表達(dá)水平有所升高但沒有顯著性差異。因此,ISL可以通過改善線粒體生物發(fā)生來維持細(xì)胞正常生理功能。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05。圖8 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of ISL on expression of mitochondrial biogenesisrelated proteins in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.8 ISL對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)mRNA表達(dá)水平的影響

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法探究ISL對(duì)RAW 264.7細(xì)胞中線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因如PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示,模型組中PGC-1α、NRF1和Tfam的表達(dá)水平都較低, 與對(duì)照組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,由此可以說明細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下線粒體生物發(fā)生過程損傷,不能行使正常的生理功能,從而表現(xiàn)出線粒體功能紊亂。ISL預(yù)處理后PGC-1α、NRF1和Tfam基因表達(dá)水平均有所提高,并與模型組相比差異較明顯。因此,ISL可以通過改善線粒體生物發(fā)生相關(guān)mRNA表達(dá)水平來維持細(xì)胞正常生理功能。

與對(duì)照組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05;##P<0.01。圖9 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相 關(guān)mRNA表達(dá)水平的影響Fig.9 Effect of ISL on mitochondrial biogenesis-related mRNA expression in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.9 ISL處理對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的影響

圖10結(jié)果顯示,細(xì)胞經(jīng)LPS處理后,RAW 264.7細(xì)胞中Drp1表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著升高,而Mfn1、2表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著下降。經(jīng)不同濃度的ISL預(yù)處理后,RAW 264.7細(xì)胞中Drp1表達(dá)水平與模型組相比有所下降,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Mfn1、2表達(dá)水平與模型組相比顯著下降,且呈良好的劑量依賴關(guān)系。因此,ISL可以通過改善線粒體融合分裂狀態(tài)來維持其平衡,對(duì)維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能至關(guān)重要。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;**P<0.01;與模型組相比,##P<0.01。圖10 ISL對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的影響Fig.10 Effect of ISL on mitochondrial dynamics in LPS-in-duced RAW 264.7 cells

4 討 論

研究發(fā)現(xiàn)大量代謝性疾病的臨床病例都存在線粒體功能障礙,為了研究線粒體功能障礙與炎癥之間的關(guān)系,本研究使用ISL預(yù)處理RAW 264.7巨噬細(xì)胞1 h,然后LPS刺激一定時(shí)間,檢測線粒體功能相關(guān)指標(biāo)。由圖3、4可知,LPS刺激成功地在RAW 264.7巨噬細(xì)胞中建立了炎癥模型,并且驗(yàn)證了ISL的抗炎活性。ISL的抗炎機(jī)制主要在于抑制NF-κB P65和AP-1的活化以及抑制ERK/MAPK通路中ERK的磷酸化水平,通過RAW264.7細(xì)胞中的ERK1/2途徑誘導(dǎo)HO-1的表達(dá),發(fā)揮下調(diào)iNOS及COX-2的基因和蛋白表達(dá)的作用[12],抑制LPS誘導(dǎo)NO、L-1β和TNF-α的產(chǎn)生,而且HO-1可以通過LPS誘導(dǎo)的NO和TNF-α的產(chǎn)生反向介導(dǎo)ISL的抗炎反應(yīng)[13]。

LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α、IL-6以及IL-1β等炎癥因子主要通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴型和MyD88非依賴型[14]。其中NO的產(chǎn)生就是由iNOS和NADPH催化L-精氨酸為瓜氨酸來完成的[15]。對(duì)于結(jié)果圖3中低濃度ISL(5 μmol/L)即對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NO水平有非常顯著的抑制作用,但圖4中只有高濃度ISL(20 μmol/L)對(duì)iNOS的水平才有明顯抑制作用,另外兩個(gè)低濃度都未見變化,可能是ISL處理損傷了NADPH氧化酶的功能,盡管有大量iNOS的產(chǎn)生,但是由于NO產(chǎn)生過程中也需要NADPH的參與,所以中低濃度ISL處理組中NO水平較低。

圖5、6結(jié)果顯示,在炎癥發(fā)生過程中,細(xì)胞中ATP和線粒體膜電勢水平顯著降低,而胞內(nèi)總ROS和線粒體源ROS水平顯著升高,經(jīng)ISL預(yù)處理可以使它們大致恢復(fù)至對(duì)照組水平。細(xì)胞中的ROS可能影響線粒體質(zhì)量數(shù)水平,本研究采用流式細(xì)胞術(shù)考察了ISL處理對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞線粒體質(zhì)量數(shù)的影響。圖7結(jié)果表明線粒體質(zhì)量數(shù)在ISL處理后顯著降低,細(xì)胞中ROS的下降可能與線粒體質(zhì)量的降低有關(guān),這可能是細(xì)胞維持能量供應(yīng)的一種補(bǔ)償機(jī)制。

線粒體生物發(fā)生受到PGC-1α、NRF1和TFam等多種因素的調(diào)控。NRF1可以促進(jìn)核編碼的線粒體蛋白的轉(zhuǎn)錄,包括參與氧化磷酸化和呼吸復(fù)合物的蛋白。Tfam可通過直接與線粒體基因組結(jié)合,增強(qiáng)線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,PGC-1α作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄共激活因子,調(diào)控NRF1和TFam等關(guān)鍵因子,并促進(jìn)線粒體生物發(fā)生[16]。當(dāng)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生變化時(shí),線粒體生物發(fā)生可能會(huì)發(fā)生紊亂。圖8和9結(jié)果表明,LPS處理顯著降低了巨噬細(xì)胞中PGC-1α、NRF1和TFam的蛋白和mRNA表達(dá)水平,而經(jīng)ISL預(yù)處理后,它們的蛋白和mRNA表達(dá)水平又可大致恢復(fù)至對(duì)照組水平。

線粒體功能障礙和形態(tài)學(xué)的改變與多種疾病密切相關(guān)[17],因此,線粒體形態(tài)的調(diào)控是細(xì)胞能量供應(yīng)充足的關(guān)鍵,需要對(duì)線粒體形態(tài)調(diào)控蛋白進(jìn)行定量和定性控制,以達(dá)到線粒體分裂與融合的動(dòng)態(tài)平衡[18-19]。本研究證實(shí)了LPS處理后線粒體形態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子的變化,如圖10所示,巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后,Drp1和Mfn1、2的蛋白表達(dá)發(fā)生了相反的變化,表明線粒體融合分裂平衡受到破壞,經(jīng)過ISL預(yù)處理后,分裂蛋白Drp1表達(dá)水平有所下降,而Mfn1、2表達(dá)水平與模型組相比顯著升高,且呈良好的劑量依賴關(guān)系。因此,ISL可能通過抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有效改善線粒體的生物發(fā)生。然而,對(duì)于線粒體形態(tài)和功能變化的確切分子機(jī)制了解甚少,也缺乏對(duì)能量代謝和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控位點(diǎn)及其如何隨疾病變化的研究。基于本研究,我們希望通過探索線粒體在各種疾病中發(fā)生的定量和定性變化,以及研究確切的分子作用機(jī)制和控制方法,開發(fā)新的治療策略。

5 結(jié) 論

本研究以RAW 264.7巨噬細(xì)胞為體外模型來評(píng)價(jià)ISL的抗炎作用與線粒體功能之間的聯(lián)系,證實(shí)了ISL可以有效改善炎癥反應(yīng)下的線粒體功能障礙,使細(xì)胞恢復(fù)正常功能。