李志勇,孫發(fā)鑫,許曉蒙,郭文娜,馮瑩瑩,袁 夢,許 卉

(煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺 264005)

小兒支原體肺炎是由支原體感染所造成的肺部急性炎癥,臨床表現(xiàn)為持續(xù)劇烈咳嗽、發(fā)熱、畏寒等[1]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿奇霉素(AZM)是治療支原體肺炎的首選抗菌藥物,其在體內(nèi)吸收迅速,達峰時間短,半衰期長,生物利用度高,分布廣泛,組織濃度明顯高于同期血藥濃度[2]。雖然AZM可在一定程度上改善臨床癥狀,但長期使用可增加藥物耐藥性,易出現(xiàn)病情反復發(fā)作、增加肺炎相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生風險,因此尋找小兒支原體肺炎更加有效的治療方案成為新的難題[3]。

近年來中藥制劑與阿奇霉素聯(lián)用被廣泛推薦用于治療小兒支原體肺炎,通過發(fā)揮藥物整體優(yōu)勢,既顯著提高療效,又減少不良反應(yīng)的發(fā)生[4-6]。喜炎平注射液(XYP)為純中藥制劑,主要成分為穿心蓮內(nèi)酯總磺化物,具有良好的解熱止咳、抗炎、抗菌、抗病毒的作用,主要用于治療支氣管炎,肺炎,細菌性痢疾等[7]。臨床研究顯示,XYP無論是單用還是與其他抗菌藥物聯(lián)用對小兒支原體肺炎均取得較好效果[8-9]。XYP與AZM聯(lián)合使用可顯著減輕患兒的炎癥反應(yīng),縮短了癥狀消失時間和住院時間,提高了臨床療效[10]。本實驗將XYP與AZM聯(lián)合應(yīng)用于肺炎模型大鼠,通過建立的LC-MS/MS方法考察AZM在大鼠心、肝、脾、肺和腎組織中的分布,探究XYP對AZM在大鼠體內(nèi)組織分布的影響,為制定合理的臨床應(yīng)用方案提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及動物

Agilent 1100高效液相色譜儀;Thremo TSQ Quantum Access三重四級桿質(zhì)譜儀;TGL-20W臺式高速冷凍離心機(上海湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);實驗室注射泵TYD02-04-CE(保定雷弗流體科技有限公司);XS-105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

喜炎平注射液(江西青峰藥業(yè)有限公司),批號:2019092103;注射用阿奇霉素(山東羅欣藥業(yè)集團有限公司),批號:518013152;阿奇霉素對照品(中國食品藥品檢定研究院),批號:130593-201303;阿霉素對照品(北京偶合科技有限公司);肺炎克雷伯標準菌株(CMCC(B)46117;中國食品藥品檢定研究院);甲醇、乙腈均為色譜純;其余試劑均為市售分析純;實驗用水為娃哈哈純凈水。

健康雄性SD大鼠12只,體重200±20 g,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司實驗動物中心提供[生產(chǎn)合格證書:SCXK(魯)2014-0007],實驗前1周進行適應(yīng)性喂養(yǎng)。動物相關(guān)的所有實驗均經(jīng)煙臺大學實驗動物倫理委員會審核并批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 AZM標準溶液:精密稱取阿奇霉素對照品1.05 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,儲備液質(zhì)量濃度為0.105mg/mL。放置4 ℃貯藏,備用。

阿霉素標準溶液:精密稱取阿霉素對照品5.07 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,儲備液質(zhì)量濃度為507 μg/mL,再逐級稀釋成質(zhì)量濃度為250 ng/mL的內(nèi)標溶液,備用。

1.2.2 大鼠細菌感染性肺炎模型建立 實驗動物為SD雄性大鼠,采用氣管注入法建立大鼠肺炎模型[11-12]。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100 g)使其麻醉,滴入0.05mL處于對數(shù)生長期的肺炎克雷伯菌(4×107CFU/mL),接種后立即豎立于固定臺,保持直立位約20 s,以保證接種菌液受重力作用流入支氣管和肺泡內(nèi)進行肺部感染。造模前大鼠全血中白細胞與中性粒細胞的數(shù)目分別為(8.61±1.11)×109個/L、(3.02±1.27)×109個/L,造模后全血中白細胞數(shù)目及中性粒細胞數(shù)分別為(22.07±5.32)×109個/L、(15.55±3.92)×109個/L,顯著增加為2.6倍和5.1倍,肺組織經(jīng)HE染色顯示有大量炎性細胞浸潤,表明造模成功。

1.2.3 動物分組與給藥方案 根據(jù)文獻,AZM在人臨床上的給藥劑量為10.0 mg/kg,換算到大鼠體內(nèi)的給藥劑量為63.0 mg/kg[13],結(jié)合體外抗炎實驗結(jié)果,最終確定AZM和XYP的聯(lián)用配比為1∶1。

造模成功的大鼠給藥處理前禁食不禁水12 h,稱重、編號后隨機分為對照組和實驗組(n=6),分別經(jīng)尾靜脈靜脈注射給予AZM和/或XYP,劑量均為63.0 mg/kg,每日1次,連續(xù)給藥1周。

1.2.4 血漿樣品采集與預處理 末次給藥24 h后,斷尾取血0.5 mL于肝素化EP管中,輕輕振搖,4 ℃下離心10 min(8 000 r/min),移取上清液于潔凈的EP管中,-20 ℃保存。

取血漿50 μL至EP管中,加入內(nèi)標溶液(250 ng/mL)50 μL、0.02 mol/L Na2CO3300 μL和乙酸乙酯-異丙醇(95∶5)2 mL,渦旋混合2 min,4 ℃下離心10 min(12 500 r/min)。取上清液至潔凈EP管中,37 ℃水浴中氮氣流吹干,加入流動相200 μL復溶,渦旋離心,取上清5 μL,進樣檢測。

1.2.5 組織樣品采集與預處理 末次給藥24 h后,脫頸椎處死大鼠,取出心、肝、脾、肺、腎,用生理鹽水洗凈組織表面浮血,濾紙吸干殘余液體,稱重,-20 ℃保存待測。

精密稱取適量組織樣品置勻漿機中,按照質(zhì)量:體積為1∶5的比例加入純水,充分勻漿,4 ℃離心10 min(3 600 r/min),取組織勻漿上清液50 μL至EP管中,依次加入內(nèi)標溶液(250 ng/mL)50 μL、0.02 mol/L Na2CO3300 μL和乙酸乙酯-異丙醇(95∶5)2 mL,渦旋混合2 min,4 ℃離心10 min(12 500r/min)。取上清液至潔凈EP管中,37 ℃水浴中氮氣流吹干,加入流動相200 μL復溶,渦旋離心,取上清5 μL,進樣檢測。

1.2.6 色譜條件 色譜柱:WATERS,ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×50 mm,1.7 μm);流動相:0.1%甲酸水-乙腈(30∶70);柱溫:30 ℃;流速:0.2 mL/min;進樣量:2 μL。

1.2.7 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子方式檢測,掃描方式為單反應(yīng)監(jiān)測(SRM),用于定量分析的離子反應(yīng)分別為AZMm/z749.20→591.04,內(nèi)標阿霉素m/z543.90→396.61,離子噴射電壓4 kV,毛細管溫度350 ℃,鞘氣壓力30 psi,輔助氣壓力5 psi,AZM和內(nèi)標的碰撞能量(CE)分別為35、17 eV。

1.2.8 方法學考察 參考中國藥典(2015版)生物樣品定量分析方法驗證的指導原則以及文獻[14-16]進行了方法學考察,主要包括專屬性、線性范圍和定量下限、精密度及準確度、回收率及基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性 取空白血漿和組織勻漿、含AZM和內(nèi)標的空白血漿和組織勻漿以及給藥后的大鼠血漿和組織勻漿,按“1.2.4”和“1.2.5”項下方法處理后進行檢測。結(jié)果顯示,血漿和組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾AZM的測定,方法的專屬性良好(圖1,僅以肝為例)。

圖1 LC-MS/MS測定大鼠肝中AZM質(zhì)量濃度的典型色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of LC-MS/MS for the determination of AZM

2.1.2 線性范圍與定量下限 取空白血漿制成含AZM質(zhì)量濃度分別為0.1,1,10,20,50,100 ng/mL的系列樣品,加入內(nèi)標(250 ng/mL)50 μL,按“1.2.4”項下方法處理后測定,記錄色譜圖,以待測藥物濃度為橫坐標,待測物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標,用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進行回歸運算,求得回歸方程(表1)。結(jié)果表明:血漿中AZM在0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.995 4),最低定量濃度為0.1 ng/mL。

取空白組織勻漿制成含AZM分別為1,10,20,50,100,200,500 ng/mL的系列樣品,加入內(nèi)標(250 ng/mL)50 μL,按“1.2.5”項下方法處理后測定,記錄色譜圖,以待測藥物濃度為橫坐標,待測物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標,用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進行回歸運算得回歸方程(表1)。結(jié)果表明:脾、肺、腎組織中AZM測定的線性濃度范圍為1～100 ng/mL,肝、心組織中AZM測定的線性濃度范圍分別為1～500 ng/mL和1～200 ng/mL(r>0.99),各組織的最低定量限均為1 ng/mL。

表1 血漿和組織中AZM測定的標準曲線Tab.1 Standard curves for quantification of AZM in plasma and various tissue samples

2.1.3 精密度與準確度 按樣品處理方法平行制備低、中、高質(zhì)量濃度含藥血漿和組織質(zhì)控樣品各9份(n=3份/批×3批),進樣檢測后計算日間、日內(nèi)精密度和準確度,結(jié)果見表2。測定結(jié)果表明:低、中、高質(zhì)量濃度AZM測定的日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于10.8%,準確度(RE)均小于10.1%,滿足生物樣品定量分析方法要求。

表2 AZM在血漿和組織中的精密度和準確度Tab.2 The precision and accuracy of AZM in plasma and tissues

2.1.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按樣品處理方法制備低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品,進樣檢測后的目標分析物的峰面積為A;將空白血漿和組織勻漿按樣品處理方法進行預處理,再加入AZM和內(nèi)標的標準溶液進樣分析,得到目標分析物的峰面積為B;制備相應(yīng)質(zhì)量濃度的標準溶液,得目標分析物的峰面積為C。以“(A/B)×100%”計算提取回收率,以“(B/C)×100%”考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果如表3所示,AZM在血漿和組織中的回收率均大于80%,均無明顯的基質(zhì)效應(yīng),符合生物樣品定量分析的要求。

表3 AZM在血漿和組織中的回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab.3 The recovery rate and matrix effect of AZM in plasma and tissues

表3(續(xù))

2.1.5 穩(wěn)定性 取空白大鼠血漿和組織勻漿,分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的標準溶液配制質(zhì)控樣品,考察樣品在自動進樣器放置24 h、室溫放置2 h、3次凍融循環(huán)及在-20 ℃下放置14 d的穩(wěn)定性,每種條件下每濃度3個平行樣本。實驗結(jié)果如表4所示,AZM在不同條件下的RSD均小于9.7%,表明血漿和組織樣品的AZM在上述條件下均具有良好的穩(wěn)定性。

表4 不同條件下AZM在血漿和組織中的穩(wěn)定性Tab.4 The stability of AZM in plasma and tissues under different conditions

2.2 組織分布研究

根據(jù)預實驗結(jié)果,血漿和各組織中的AZM濃度均遠高于標準曲線的范圍,因此對血漿和組織勻漿進行稀釋,血漿稀釋5 000倍,心稀釋2 000倍,肝稀釋10 000倍,脾、肺、腎均稀釋20 000倍。肺炎模型大鼠聯(lián)合給藥與單獨給藥后的AZM組織分布測定結(jié)果見圖2。結(jié)果表明:與對照組相比,實驗組AZM在肝中的質(zhì)量分數(shù)顯著降低(P<0.05),在血漿和其他組織中未見有顯著性差異。研究結(jié)果表明,XYP可促進AZM在大鼠肝中的代謝,從而顯著降低其在肝臟的藥物蓄積,有利于改善AZM長期用藥造成的肝損傷。

與對照組相比,*P<0.05。圖2 給藥后AZM在各組織的分布Fig.2 Distribution of AZM in various tissues after administration

3 討 論

近年來小兒支原體肺炎發(fā)病率居高不下,嬰幼兒為主要發(fā)病人群,占兒童社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%[17]?；谇捌诘南到y(tǒng)評價和Meta分析發(fā)現(xiàn),喜炎平注射液和阿奇霉素的聯(lián)合方案可能是臨床上治療小兒支原體肺炎的有效和安全的方法,為二者聯(lián)用提供了強有力的理論依據(jù)[18]。前期的體內(nèi)藥效學研究結(jié)果表明，建立的肺炎克雷伯菌感染的大鼠肺炎模型經(jīng)過多次給藥之后,XYP聯(lián)用AZM顯著抑制肺組織中肺炎克雷伯菌的增殖,降低肺組織中菌落的數(shù)量,減輕肺組織的病變程度,顯示出良好的抗炎效果,在體內(nèi)具有明顯的藥效學相互作用。

本實驗建立了一種靈敏、快速、高效的LC-MS/MS方法,測定肺炎大鼠血漿和組織內(nèi)的AZM濃度,考察XYP對AZM在大鼠體內(nèi)各組織的影響。研究表明,與對照組相比,實驗組顯著降低AZM在肝組織中的藥物蓄積,推測可能的原因是XYP能通過影響肝臟的藥物代謝酶從而促進AZM的代謝,有利于緩解長期使用AZM對肝的損傷。

4 結(jié) 論

本研究以肺炎大鼠作為模型,建立的LC-MS/MS方法考察符合生物樣品分析指導原則的要求,適于測定大鼠血漿和組織中AZM濃度,AZM與XYP聯(lián)用較AZM單用顯著降低肝臟中AZM的藥物蓄積,一定程度上減輕了肝毒性,為其臨床應(yīng)用進一步增添有利證據(jù)。