劉 歡,沙春潔,邵 馨,劉萬卉,

(1. 煙臺大學藥學院，分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學)，新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 煙臺，264005；2.山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室，山東 煙臺 264003)

納武利尤單抗(百時美施貴寶,Nivolumab)是一種全人源化IgG4單克隆抗體,它可以選擇性地與PD-1結合并阻止PD-1和PD-L1或PD-L2之間在腫瘤上的相互作用,從而防止T細胞衰竭;還可以使已經衰竭的T細胞重新激活,發(fā)揮免疫作用,殺死腫瘤細胞,從而減緩或阻止腫瘤生長,以達到治療目的[1]。該藥于2015年在美國獲批用于治療非小細胞肺癌(NSCLC),現已獲批用于15個適應癥、8個瘤種的治療。 為評估藥物在受試者體內的藥代動力學特征,需定量檢測各時間點采集的血清樣本中的藥物濃度。目前抗體藥物定量檢測的首選方法是配體結合法(Ligand binding assay, LBA)[2],此類方法中的酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)因成本低、操作簡單、通量高而最為常用。ELISA是酶催化底物顯色,通過測定特定波長下顯色底物吸光度來進行定量的方法,而酶催化底物從開始顯色到顯色飽和的濃度范圍較窄,所以此方法檢測范圍較窄，對于高濃度的血漿樣品往往需要多步稀釋,操作繁瑣。因此，為了減少樣品處理時間,有必要建立一種檢測范圍比ELISA更寬的方法。

時間分辨熒光免疫檢測技術(Time-resolved fluorescence immunoassay, TRFIA)是基于鑭系螯合物(Eu, Sm, Tb, Dy)發(fā)出的熒光來檢測待測物的免疫分析法,鑭系元素的熒光壽命遠高于血清樣本中存在的熒光物質,可在本底熒光衰變后檢測鑭系元素的熒光信號,從而降低熒光物質的干擾[3]。信號響應隨熒光標記物濃度增大而增大的范圍寬,因此檢測范圍也更寬。目前TRFIA較多地應用于細胞因子、生物標志物、蛋白、多肽等的檢測[4-7]?；谂潴w結合原理,標記有鑭系元素的二抗與藥物結合也能實現對抗體藥物的定量檢測。本實驗建立了基于TRFIA法檢測食蟹猴血清中抗體藥納武利尤的方法,對其進行了方法學驗證,結果符合中國藥典對生物樣品檢測的要求。對食蟹猴靜脈給藥納武利尤單抗的血清樣本進行檢測,并與經過驗證的ELISA方法進行了比較。

1 材 料

1.1 動物

體重3.0～5.0 kg的雄性食蟹猴3只[來自廣州相觀生物科技有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(粵)2018-0043,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2016-0090]?？瞻资承泛飩€體血清(北京匯智泰康醫(yī)藥技術有限公司)。

本試驗涉及的動物福利均遵循湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司動物福利指導原則(指導原則編號:GAW 018-2018)。研究提交實驗動物使用和管理委員會(IACUC)審核和批準。試驗期間動物管理和使用遵循美國National Academy Press出版的《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》(2011)、國家科學技術委員會2017年修訂的《實驗動物管理條例》。本試驗所涉及的動物管理、使用和相關操作均經過湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司實驗動物管理和使用委員會(IACUC)批準,批準文號:IACUC(準)-2019-076。

1.2 試劑耗材

供試藥物:納武利尤單抗(Opdivo,批號:ABA8488,百時美施貴寶公司); 生物素標記藥物: Biotin-opdivo (山東博安生物技術有限公司進行生物素標記);Eu標記的山羊抗人 IgG 抗體、解離增強液、低熒光96孔板均來自于PerkinElmer;PD-1蛋白(R&D systerm);高吸附96孔板(Thermo);TMB(sigma);HRP標記的山羊抗人IgG抗體(SouternBiotech)。

1.3 儀器

酶標儀(型號:SpectraMaxM5e,來源:Molecular Devices),微孔板恒溫振蕩器(型號:PHMP-4,來源:Grant bio),洗板機(型號:405LS,來源:BioTeK)。

2 方 法

2.1 TRFIA方法的建立

參照已有的ELISA方法,選擇間接TRFIA法作為檢測方式。實驗步驟為:PD-1蛋白100 μL/孔包板,4 ℃靜置過夜,次日用1% BSA封閉,37 ℃振蕩孵育1 h,洗板后上樣,樣品100 μL/孔,37 ℃振蕩孵育1 h,加入Eu標記的山羊抗人IgG抗體,100μL/孔,孵育1 h;洗板后加解離增強液,200 μL/孔,室溫振蕩15 min,讀取時間分辨熒光,采用四參數回歸方程擬合標準曲線,計算樣品濃度。對讀板條件、PD-1蛋白包板質量濃度、Eu標記的山羊抗人 IgG 抗體質量濃度進行摸索。

2.2 ELISA方法

微孔板包被PD-1蛋白,4 ℃靜置過夜,次日用1% BSA封閉,37 ℃振蕩孵育1 h,洗板后上樣,37 ℃振蕩孵育1 h,加入HRP標記的山羊抗人IgG抗體,孵育1 h;洗板后加TMB,100 μL/孔,室溫避光反應25 min,1 mol/L磷酸終止,讀板。

2.3 TRFIA方法學驗證

根據2020版中國藥典生物樣品定量分析指導原則項下配體結合分析[8]進行方法學驗證。

2.4 動物實驗

食蟹猴靜脈推注單次給藥,劑量為3 mg/kg,給藥體積0.3 mL/kg,在給藥肢體的對側前肢或后肢皮下靜脈取血,血樣采集時間點:給藥前(0 h),給藥開始后0.25 h(15 min)、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h(D 2)、72 h(D 4)、168 h(D 8)、240 h(D 11)、336 h(D 15)、504 h(D 22)。收集全血至采集管中,待血液凝結后2～8 ℃離心,3500 r/min,離心10 min,分離血清,放置于-80 ℃超低溫冰箱凍存待測。

2.5 樣品檢測

分別用TRFIA和ELISA方法對食蟹猴血清樣品進行檢測,并比較兩組數據的差異。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用 WinNolin(8.1)軟件的非房室模型法(NCA)對藥代動力學參數進行計算。利用 Micro-soft Excel(2010)計算均值、標準差和變異系數。

3 結 果

3.1 方法優(yōu)化結果

3.1.1 熒光條件選擇 Eu3+螯合物通常在615 nm處有最大發(fā)射光[9],讀取激發(fā)光為250～450 nm,發(fā)射光為615 nm的熒光,得到圖1所示的激發(fā)光譜,由圖1可知 Eu3+螯合物在激發(fā)波長為340 nm,發(fā)射波長為615 nm條件下有最強的熒光信號,因此選擇此條件進行檢測。

圖1 Eu3+螯合物激發(fā)光譜Fig.1 Eu3+ chelate excitation Spectrum

3.1.2 時間分辨條件選擇 考察在不同時間分辨條件下對本底熒光的消除情況,結果如表1所示,沒有經過時間延遲,猴血清和空白板有很強的熒光信號,200 μs過后,本底熒光很小,對檢測幾乎沒有影響。但Eu3+螯合物仍有很強的熒光信號。

表1 時間分辨設置Tab.1 TRF setting

3.1.3 捕獲抗原質量濃度的選擇 PD-1蛋白用PBS配制成0.5、1、2、4、10 μg·mL-1,100 μL/孔包板,4 ℃靜置過夜,次日封閉后加入高濃度的納武利尤單抗,37 ℃振蕩孵育1 h,加入Eu標記的山羊抗人IgG抗體,100 μL/孔,孵育1 h;洗板后加解離增強液,200 μL/孔,室溫振蕩15 min,在激發(fā)光340 nm,發(fā)射光615 nm波長下讀取經200 μs延遲至1 000 μs的熒光。由包板質量濃度-熒光積分值曲線(圖2)可知，當包板質量濃度大于2 μg·mL-1時,熒光計數趨于飽和,因此2 μg·mL-1的PD-1為最佳包板質量濃度。

圖2 不同PD-1包板質量濃度下的結合曲線Fig.2 Binding curves at different PD-1 coating concentrations.

3.1.4 不同Eu3+-山羊抗人IgG抗體質量濃度的選擇 考察PD-1包板質量濃度為2 μg·mL-1,納武利尤單抗 100 ng·mL-1條件下不同質量濃度標記二抗特異性/非特異性響應信號值,結果如圖3所示,檢測抗體質量濃度為100 ng·mL-1時,特異性/非特異性信號比最高,因此選擇100 ng·mL-1的銪標記山羊抗人IgG抗體進行檢測。

圖3 不同Eu3+-山羊抗人IgG質量濃度的特異性和非特異性結合曲線Fig.3 Specific and non-specific binding curves at different Eu3+-goat anti-human IgG concentrations

3.1.5 優(yōu)化后的實驗流程 2 μg·mL-1PD-1蛋白100 μL/孔包板,4 ℃靜置過夜,次日用1% BSA封閉,37 ℃振蕩孵育1 h,洗板后上樣,標曲質控用空白食蟹猴血清配制,與待測樣品在上樣前用0.1% BSA/PBST溶液稀釋,100 μL/孔上樣,37 ℃振蕩孵育1 h,加入100 ng·mL-1Eu標記的山羊抗人IgG抗體,100 μL/孔,孵育1 h;洗板后加解離增強液,200 μL/孔,室溫振蕩15 min,讀取激發(fā)波長為340 nm,發(fā)射波長為615 nm,200～1 000 μs時間分辨熒光積分值。

3.2 方法學驗證結果

3.2.1 標準曲線范圍 對標準系列質量濃度樣品(2 500、625、156.25、39.06、9.77、2 ng·mL-1)進行檢測,所得的熒光強度積分值與質量濃度值GraphPad軟件經過四參數擬合,得到標準曲線回歸方程為y=(A-D)/(1+x/C)B,A=2 244,B=0.922,C=113.9,D=2.74,R2=1.000 0,標準曲線見圖4。方法的定量范圍為2～2 500 ng·mL-1,靈敏度為2 ng·mL-1。

圖4 納武單抗的四參數校正曲線Fig.4 Calibration curve of nivolumab detection

3.2.2 精密度和準確度 連續(xù)3天共評價了6批質控樣品,每批包含1套標準曲線(2 500、625、156.25、39.06、9.77、2 ng·mL-1),5套質控樣品(2 500、2 000、300、5、2 ng·mL-1)。各質量濃度標曲、質控樣品用空白食蟹猴血清配制,上樣前用0.1% BSA/PBST稀釋液稀釋50倍。批內批間準確度均值應在質控樣品標示值的±20%范圍內,對于定量下限和定量上限,應在標示值的±25%范圍內。批內批間變異系數一般不得超過20%,定量上下限的變異系數不得超過25%。精密度準確度結果見表2。定量上限、定量下限的批內精密度在 3.6%～14.2%范圍內,批間精密度在10.0%～10.6%范圍內。低、中、高質量濃度質控的批內精密度在 1.2%～16.5%內,批間精密度在 9.6%～12.2%范圍內。定量上下限的準確度在-14.3%～11.9%。低中高質量濃度質控準確度在-14.3%～11.4%范圍內。符合中國藥典要求。

表2 方法精密度與準確度(n=6)Tab.2 Precision and accuracy of method(n=6)

3.2.3 穩(wěn)定性 考察高、低兩個質量濃度水平的質控樣品(2 000、5 ng·mL-1)在實驗臺上穩(wěn)定性(樣品預處理后室溫放置4 h,室溫放置12 h)、長期穩(wěn)定性(-80 ℃凍存1個月)以及反復凍融穩(wěn)定性(3個周期),每個考察條件的高、低質量濃度樣品各三份。實驗結果見表3,結果表明,各個考察條件的質控樣品回算質量濃度的回收率在理論質量濃度的92.1%～101.5%范圍內,精密度在7.0～18.8%內,滿足中國藥典接受標準。

表3 納武利尤單抗在食蟹猴血清中的穩(wěn)定性Tab.3 Stability of nivolumab in cynomolus monkey serum

3.2.4 選擇性 選擇10個空白個體血清進行選擇性考察。10個個體的空白樣品均不能檢測到納武利尤單抗,LLOQ回收率在理論質量濃度的80.2%～118.9%范圍內,說明基質中存在的非相關物質對檢測沒有干擾。

3.2.5 稀釋線性和鉤狀效應 對150 000、30 000、3 000、600 ng·mL-1的納武利尤單抗食蟹猴血清樣本用空白食蟹猴血清稀釋后進行檢測,回收率在82.5%～111.9%,精密度在2.8%～15.1%,表明不同的稀釋倍數不影響檢測的準確性。對上述樣品不經空白食蟹猴血清稀釋檢測,熒光讀數隨濃度增加而增加,說明在600～10 000 ng·mL-1范圍內無鉤狀效應。

3.2.6 樣品檢測結果 通過TRFIA和ELISA兩種方法檢測對來自3只食蟹猴的33個血清樣本獲得的藥時曲線圖見圖5;用 WinNolin(8.1)軟件的非房室模型法(NCA)對藥代動力學參數進行計算，結果見表4。TRFIA和ELISA兩種方法測得的藥時曲線趨勢相似,兩種方法所測數據用 Micro-soft Excel(2010)進行單因素方差分析,P>0.05,說明兩種方法所測數據間無顯著性差異。對TRFIA與ELISA檢測來自3只動物的33個血清樣本結果進行線性擬合,擬合的曲線見圖6,得到的線性回歸方程為y=0.986 85x+1.286 42(R2=0.941 73),表明兩種方法相關性良好。

圖5 TRFIA、ELISA兩種方法測得納武利尤單抗在食蟹猴體內的藥時曲線Fig.5 plasma concentration-time profiles of nivolumab in cynomolgus monkey determined by TRFIA and ELISA

表4 TRFIA和ELISA檢測食蟹猴血清中納武利尤單抗的藥代動力學參數Tab.4 Pharmacokinetic parameters of plasma from cynomolgus monkeys based on drug-concentration of nivolumab,as determined by TRFIA and ELISA

圖6 TRFIA、ELISA兩種方法測得測得納武利尤單抗質量之間的線性關系Fig.6 Linear correlation between the nivolumab concentration determined by TRFIA and ELISA

4 討論與結論

本實驗首次建立了TRFIA法檢測納武利尤單抗在食蟹猴血清中濃度的方法,對間接TRFIA法的熒光條件、時間分辨條件、捕獲抗原質量濃度、檢測二抗質量濃度進行了比較,確定了最佳讀板條件為激發(fā)波長340 nm,發(fā)射波長615 nm,在時間分辨模式下讀取200～1000 μs熒光,最佳包板質量濃度為2 μg/mL,最佳Eu標記山羊抗人IgG抗體質量濃度為100 ng·mL-1。對該方法進行了方法學驗證,結果符合中國藥典對生物分析方法的要求。PLUIM D等[10]開發(fā)的ELISA法檢測人血清和腦脊液中納武利尤單抗,檢測范圍為2～100 ng·mL-1。本實驗建立的TRFIA方法與ELISA法相比,靈敏度相當,但檢測范圍更寬,檢測范圍為2～2 500 ng·mL-1,是ELISA法的25倍。對于食蟹猴血漿樣品,兩種方法檢測結果間的差異無統(tǒng)計學意義。與其他配體結合法相比,TRFIA沒有放射性免疫法的放射性污染的缺點[11];試劑耗材價格遠低于電化學發(fā)光法(ECL);線性范圍比ELISA寬,因此TRFIA有望在抗體藥物的藥代動力學研究中有更廣的應用。