張 娜 ， 劉 葒 ， 謝艷輝 ， 黃 磊 ， 孫思陽 ， 斯?jié)啥?， 李家僑

(1. 湛江海關(guān)技術(shù)中心 ， 廣東 湛江 524000 ； 2. 深圳海關(guān)動植物檢驗檢疫技術(shù)中心 ， 廣東 深圳 518045 ；3. 南昌海關(guān)技術(shù)中心 ， 江西 南昌 330038)

環(huán)境DNA(Environmental DNA，eDNA)是環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)的許多不同生物體基因組DNA的復(fù)雜混合物[1]。土壤、沉淀物、水甚至糞便被視為環(huán)境樣品，其中也包括過濾空氣或水、過濾沉積物或大塊狀樣品所產(chǎn)生的物質(zhì)[2]。水作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要環(huán)境介質(zhì)，是病毒傳播和運輸?shù)淖钪匾慕M成部分[3]，但是由于水中的病毒滴度低，并且水的樣品成分復(fù)雜，需要進(jìn)行水樣品處理來得到足夠量的病原數(shù)量進(jìn)行檢測，而在這方面的研究較少。從大量的環(huán)境水中進(jìn)行病毒的濃縮，來研究水環(huán)境DNA中的病毒檢測方法對樣品處理要求較高。

白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是一種包膜雙鏈DNA病毒，屬于線頭病毒科(Nimaviridae)白斑病毒屬。WSSV病毒粒子呈卵圓形、橢圓形或桿狀，規(guī)則對稱，直徑80～120 nm，長250～380 nm。它已成為蝦養(yǎng)殖中的一種破壞性病毒病原體。該病毒的宿主范圍廣泛，WSSV可垂直傳播，也可經(jīng)水和攝食感染組織(如殘食同類、捕食等)進(jìn)行水平傳播，或通過諸如多毛蠕蟲、餌蝦、輪蟲甚至可能是鳥類等攜帶者傳播[4]。一些研究嘗試在水中檢測WSSV。

Hossain等[5]通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對水樣離心分離得到的沉積物進(jìn)行了測試，并報告了12份蝦池和水樣中的5份檢測WSSV呈陽性，該方法對病毒顆粒通過過濾器，并在低速離心后使病毒保持懸浮狀態(tài)。Quang等[6]研究稱，可以在沿海環(huán)境中檢測到WSSV，如病蝦池和周圍運河，使用膜過濾，該方法僅捕獲黏附在過濾膜上的海水顆粒物上的病毒。這些研究采用離心法和膜過濾法，未采用病毒濃縮法，因此，這些方法可能低估了水中真實的病毒量。

切向流過濾(Tangential flow filtration，TFF)是指液體流動方向與過濾方向呈垂直方向的過濾形式，采用交叉流動過濾形式，流向是切向于過濾膜表面。只有小部分液體透過過濾介質(zhì)，截留的顆粒從膜的表面被“掃除”。切向流膜過濾技術(shù)適用于較大規(guī)模樣品處理。傳統(tǒng)的微孔過濾，包括除菌過濾所采用的過濾形式，其液體的流動方向與過濾方向一致，隨著過濾的進(jìn)行，過濾膜表面形成的濾餅層或凝膠層厚度逐漸增大，流速逐漸降低。當(dāng)過濾介質(zhì)為孔徑細(xì)小的超濾膜或微濾膜時料液中固形物含量很高時，流速將急速降低，因此傳統(tǒng)的過濾只能處理小體積的樣品。對于較大規(guī)模的樣品過濾時，需要采用切向流過濾方式，液體流動在過濾介質(zhì)表面產(chǎn)生剪切力，減小了濾餅層或凝膠層的堆積，保證了穩(wěn)定的過濾速度。

本試驗是探討切向流過濾超濾(Ultrafiltration，UF)技術(shù)濃縮養(yǎng)殖水樣中的病毒濃度的有效性，以特異性檢測WSSV病原體，對水生動物環(huán)境水中的病毒研究提供有效的樣品處理方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 實驗室保存的患白斑綜合癥的南美白對蝦陽性樣品；DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen,德國)；PremixExTaq(Probe qPCR),購自寶生物(TaKaRa)工程(大連)有限公司；微滴式數(shù)字PCR用探針法反應(yīng)預(yù)混液(含dUTP)、樣本制備通用試劑盒(廣州永諾生物科技有限公司)；PCR管、吸嘴等均為Axygen產(chǎn)品。0.2 μm孔徑TFF濾筒(CFP-2-E-4MA，表面積420 cm2)，超濾濾柱UFP-100-C-4MA、UFP-300-C-4MA、UFP-100-E-4MA(GE Health Care Bio Sciences Corp.)。

1.2 主要儀器設(shè)備 熒光定量PCR儀(ABI 7500)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 5417R)；真空泵(津騰，GM-0-33A)；基因擴(kuò)增儀(ETC 811，東勝龍)；真空離心濃縮儀(ZL3-1K，湖南可成儀器)；數(shù)字PCR樣本制備儀(MicroDrop-100A，廣州永諾生物科技有限公司)；數(shù)字PCR生物芯片閱讀儀(MicroDrop -100B，廣州永諾生物科技有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 預(yù)過濾 取直徑為50 mm的孔徑為1 μm的玻璃纖維素膜進(jìn)行雜質(zhì)預(yù)初濾去除較大顆粒物，濾過的水經(jīng)過50 mm的孔徑為0.65 μm的玻璃纖維素膜經(jīng)過初濾，保存濾過的水和膜。

1.3.2 微過濾 經(jīng)過預(yù)過濾的水經(jīng)過初過濾后水樣放置在“原液瓶”中，通過連接管連接蠕動泵、壓力表、0.2 μm孔徑過濾柱(CFP-2-E-4MA)。過濾柱出來的樣品分別接回流管和透過液管?；亓鞴苓B接“原液瓶”，透過液管連接“透過液瓶”。

取“透過液瓶”進(jìn)行下一步處理。每次使用后，用200 ppm游離氯和0.5 mol/L氫氧化鈉溶液對過濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾消毒1 h。檢查滲透物的酸堿度達(dá)到pH 7.0，以確保完全去除次氯酸鈉。

1.3.3 水中病毒富集 經(jīng)過微過濾后“透過液瓶”的水樣全部放置在“濃縮液瓶”中，通過連接管連接蠕動泵、壓力表、100kDa孔徑超濾濾柱(UFP-100-C-4MA)的過濾裝置中進(jìn)行病毒濃縮。調(diào)節(jié)蠕動泵控制控制濃縮過程的壓力為0.2～0.3 bar。當(dāng)“濃縮液瓶”中樣品濃縮為100～150 mL時，可結(jié)束濃縮。每次使用后，用200 ppm游離氯和0.5 mol/L氫氧化鈉溶液對過濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾消毒1 h[7]。

1.3.4 水濃縮樣品總DNA提取 取濃縮液和透過液，分別使用DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒進(jìn)行DNA核酸抽提，采用世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動物疾病診斷手冊》[8]中WSSV熒光PCR方法的引物和探針序列進(jìn)行病毒檢測，F(xiàn)：5′-TGGTCCCGTCCTCATCTCAG-3′;R:5′-GCTGCCTTGCCGGAA-ATTA-3;探針 5′-FAM-AGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACA-TAMRA-3′。

1.3.5 數(shù)字PCR檢測方法建立 微滴式數(shù)字PCR用探針法反應(yīng)預(yù)混液(含dUTP) 5 μL、引物-F(10 μmol/L) 1.8 μL、引物-R(10 μmol/L)1.8 μL、探針(10 μmol/L) 0.5 μL、模板 10 μL，總體積為 20 μL。 (1)將微液滴生成芯片置于芯片卡座中，向油相孔加入40 μL微液滴生成油，向樣本孔中加入20 μL 已加入樣本的PCR反應(yīng)水相。待油相和水相加入完成后，蓋上微液滴生成芯片密封墊，將微液滴生成芯片置于MicroDrop-100A樣本制備儀中進(jìn)行微液滴生成；(2)待微液滴生成后，依次小心將生成的微液滴(45～55 μL)轉(zhuǎn)移至96孔PCR反應(yīng)板中；擴(kuò)增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s,45個循環(huán)；98 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增完后，將96孔PCR反應(yīng)板置于MicroDrop-100B生物芯片閱讀儀中進(jìn)行檢測；使用QuantDrop數(shù)據(jù)分析軟件分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.3.6 不同孔徑的膜進(jìn)行超濾對比 用UFP-100-C-4MA(面積為650 cm2)和UFP-300-C-4MA(面積為650 cm2)分別對1L的樣品進(jìn)行過濾，對比不同孔徑的膜的過濾效果。用UFP-100-C-4MA(面積為650 cm2)和 UFP-100-E-4MA(面積為420 cm2)不同面積的膜進(jìn)行過濾，對比相同孔徑時，不同膜面積的過濾效果。

1.3.7 檢測對切向流WSSV的濃縮回收率 用已知WSSV陽性的病毒濃縮水樣，取100 mL已知濃度的陽性病毒水樣，加水稀釋到1L，依次稀釋共得到4個 梯度，分別把樣品濃縮到150 mL。每個樣品分取200 μL濃縮后的樣品200 μL、濃縮的透過樣品200 μL進(jìn)行DNA抽提得到核酸50 μL，然后進(jìn)行數(shù)字PCR定量檢測病毒拷貝數(shù)，同時用熒光PCR方法檢測。

1.3.8 對切向流濃縮回收WSSV的重復(fù)性檢測 用已知WSSV陽性的病毒濃縮水樣，平行取10個樣品，每個樣品為1L，分別把樣品濃縮到150 mL。分別取濃縮后的樣品200 μL、濃縮的透過樣品200 μL進(jìn)行DNA抽提，然后進(jìn)行數(shù)字PCR定量檢測病毒拷貝數(shù)，同時用熒光PCR方法檢測。

2 結(jié)果

2.1 不同孔徑的膜進(jìn)行超濾對比 用UFP-100-C-4MA (孔徑100 kDa)和UFP-300-C-4MA(孔徑300 kDa)分別進(jìn)行過濾，發(fā)現(xiàn)UFP-300-C-4MA濃縮后可以在透過液中檢測到陽性，說明該膜會影響病毒回收率。同時，用不同面積的膜進(jìn)行過濾，發(fā)現(xiàn)使用較小面積的濾筒UFP-100-E-4MA(面積為420 cm2)，通過粗濾、MF和UF等不同步驟獲得病毒濃縮物的時間大約需要6.5 h以上，而使用具有較大表面積的UFP-100-C-4MA(面積為650 cm2)濾筒的時間大大縮短到4 h以下。對比2個不同面積的膜，在相同3 h濃縮過程中，濃縮液流速是透過液流速的3倍時，透過液檢出陽性，說明膜面積較小的話，會有機(jī)會透過病毒而影響濃縮，見圖1。

圖1 不同孔徑和不同面積超濾膜濃縮對比Fig.1 Comparative concentration efficiency of ultrafiltration membranes with different pore sizes and areas1：UFP-100-C-4MA濃縮病毒液； 2：UFP-100-C-4MA濃縮病毒液；3：UFP-100-E-4MA濃縮病毒液； 4：UFP-300-C-4MA濃縮病毒液；5：UFP-300-C-4MA濃縮透過液； 6：UFP-100-E-4MA濃縮透過液；7：UFP-100-C-4MA濃縮透過液； N：陰性對照；P：陽性對照1:UFP-100-C-4MA virus concentrate; 2:UFP-100-C-4MA virus concentrate; 3:UFP-100-E-4MA virus concentrate; 4:UFP-300-C-4MA virus concentrate; 5:UFP-300-C-4MA concentrated permeate; 6:UFP-100-E-4MA concentrated permeate; 7:UFP-100-C-4MA concentrated permeate;N:Negative control;P:Positive control

2.2 數(shù)字PCR和熒光PCR檢測切向流過濾回收WSSV的回收率 如圖2所示，用數(shù)字PCR方法定量檢測病毒回收效果的結(jié)果顯示，1和2孔道是UFP-100-C-4MA濃縮透過液樣品，檢測結(jié)果為陰性，而UFP-300-C-4MA濃縮透過液的樣品檢測結(jié)果為弱陽性，這個結(jié)果與2.1結(jié)果一致。說明用UFP-300-C-4MA的孔徑的膜會有病毒透過從而影響回收濃縮。在對樣品原液進(jìn)行10倍稀釋后而用UFP-100-C-4MA濃縮的結(jié)果顯示，病毒原液拷貝數(shù)分別7.923×106和8.496×106，在分別進(jìn)行10、102、103和104倍的梯度稀釋并做平行樣，病毒濃縮回收率分別為87.8%/89.45%、69.09%/61.95%、78.05%/69.67%和70.00%/65.38%，回收率均在60.00%以上。在稀釋樣品時，也出現(xiàn)病毒量沒有很好平均而影響定量數(shù)字PCR病毒量。4次稀釋的平均濃縮回收率為73.92%，濃縮效果較好。

從熒光PCR檢測結(jié)果來分析，樣品原液在進(jìn)行10倍梯度稀釋時，病毒濃縮回收結(jié)果呈倍比稀釋，同時，檢測透過液均為陰性。平行樣的結(jié)果均一致。數(shù)字PCR結(jié)果與熒光PCR結(jié)果一致，倍比稀釋的回收率效果較好，見圖3。

圖3 熒光PCR比對病毒濃縮回收率效果Fig.3 Determination of virus concentration recovery rate by fluorescent PCR1和2：病毒稀釋原液樣品； 3和4：原液稀釋10倍樣品；5和6：原液稀釋102倍樣品； 7和8：原液稀釋103倍樣品；9和10：原液稀釋104倍樣品； 11和12：UFP-300-C-4MA濃縮透過液樣品； 13和14：UFP-100-C-4MA濃縮的透過液； P：陽性對照；N：陰性對照1 and 2:Original virus sample; 3 and 4:Dilute 10 times sample; 5 and 6:Dilute 102 times sample; 7 and 8:Dilute 103 times sample; 9 and 10:Dilute 104 times sample; 11 and 12:UFP-300-C-4MA concentrated permeate; 13 and 14:UFP-100-C-4MA concentrated permeate; P:Positive control; N:Negative control

2.3 數(shù)字PCR檢測切向流過濾回收WSSV的重復(fù)性 平行做10個稀釋樣品，分別進(jìn)行濃縮回收，用數(shù)字定量PCR檢測后的結(jié)果顯示，每個樣品的病毒濃度差異不顯著，病毒濃縮回收重復(fù)性較好，見圖4。熒光PCR結(jié)果顯示，10個樣品的濃縮重復(fù)性較好，而用熒光PCR方法檢測透過液均為陰性，見圖5。數(shù)字PCR結(jié)果與熒光PCR結(jié)果一致，病毒濃縮的回收重復(fù)性較高。

圖4 數(shù)字PCR比對病毒濃縮重復(fù)性效果(核酸為50 μL)Fig.4 Repeatability of virus concentration revealed by digital PCR (Nucleic acid was 50μL)1～10：濃縮病毒液樣品，50 μL核酸中病毒拷貝數(shù)分別為1.989×106、1.919×106、1.911×106、1.933×106、2.049×106、2.006×106、2.034×106、2.019×106、1.923×106、1.996×1061-10:Concentrated virus sample,the copy number of virus in 50 μL nucleic acid was 1.989×106,1.919×106,1.911×106,1.933×106,2.049×106,2.006×106,2.034×106,2.019×106,1.923×106,1.996×106,respectively

圖5 熒光PCR比對病毒濃縮重復(fù)性效果Fig.5 Repeatability of virus concentration revealed by fluorescent PCR1～10濃縮回收液：10個平行樣品濃縮回收液；1～10濃縮透過液：10個平行樣品濃縮透過液；P：陽性對照；N：陰性對照Concentrated virus sample of sample 1-10:Concentrated recovery solution of 10 duplicate samples；Concentrated permeate virus sample of sample 1-10:Concentrated penetrant of 10 duplicate samples; P:Positive control; N:Negative control

3 討論

目前，對水樣處理的方法還有濾膜過濾法、吸附洗脫法、沉淀法、超速離心法、免疫磁珠分離法等[9]。這些方法均有優(yōu)點，但是也有成本高、設(shè)備復(fù)雜等局限性，而洗脫法、沉淀法、免疫磁珠法，水樣本身的水質(zhì)狀況也會一定程度影響病毒回收效果，對于小病毒更多具有不適合的特點[10]。

切向流超濾中泵推動流體通過濾膜表面，沖刷去除其上截留的分子，從而使濾膜表面的積垢程度降至最低。在滲余物流體中產(chǎn)生緊靠濾膜的壓力，使溶質(zhì)和小分子通過濾膜。在直流過濾中，增加壓力，僅能對混合物施加壓力，而無助于分離的促進(jìn)；相比之下，在切向流超濾模式中，通過混合物的再循環(huán)防止限制層的形成，此再循環(huán)類似于振動以去除阻塞篩網(wǎng)眼的鵝卵石，使得位于混合物頂部的砂粒落下并通過篩網(wǎng)眼。因此，利用切向流超濾進(jìn)行生物分子分離，效率更高，濃縮或洗濾速度更為快捷。但是，由于超濾法使用的濾膜孔徑太小，容易堵塞[11]，所以要先進(jìn)行預(yù)過濾來去除較大的雜質(zhì)。本試驗中在進(jìn)行樣品的微濾和超濾之前，使用1 μm孔徑和0.65 μm孔徑的過濾膜先進(jìn)性預(yù)過濾，這一步驟減少了預(yù)封閉超濾膜的需要，并提高了水中病毒的回收率。

病毒濃度與倍數(shù)濃度和處理水量成正比[12]，檢測蝦致病性病毒的機(jī)會取決于池塘/孵化場水的污染程度。超濾技術(shù)對病毒顆粒的回收和截留直接或間接地與許多變量有關(guān)，如試驗條件、濾筒總面積、泵速、泵壓、分子和顆粒大小和形狀、濃度等，以及可能在海水電解質(zhì)中引起靜電吸引的粒子極性等[13-14]。王建等[15]建立了切向流超濾富集法對飲用水中諾如病毒的檢測，即用超濾膜進(jìn)行第1次富集，用PEG第2次富集，結(jié)果顯示，該方法檢測的靈敏度為模擬水樣10-4copies/μL，平均回收率為10%～20%，抑制指數(shù)均少于2。本試驗中，比對了孔徑300 kDa和100 kDa的超濾膜的濃縮WSSV效果，因為WSSV病毒粒子直徑80～120 nm，長250～380 nm，呈卵圓形、橢圓形或桿狀，在孔徑300 kDa的透過液中檢測到病毒，說明使用該孔徑太大，影響濃縮效果。

第3代PCR技術(shù)—數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)是一種核酸分子絕對定量分析技術(shù)[16-17]，它是一種將PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋，隨后在大量不同的反應(yīng)單元中進(jìn)行獨立的PCR擴(kuò)增，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)的技術(shù)，而樣本中DNA的提取質(zhì)量會影響檢測結(jié)果，本試驗中出現(xiàn)的樣本檢測結(jié)果有差異性，分析原因可能與稀釋樣品效果不好有關(guān)，也可能與DNA提取質(zhì)量有關(guān)。但是，從結(jié)果分析來看數(shù)字PCR結(jié)果與熒光PCR結(jié)果一致，倍比稀釋的回收率效果較好。用數(shù)字PCR定量檢測樣品中病毒量，4次稀釋的平均濃縮率為73.92%，濃縮效果較好。平行做10個重復(fù)性樣品分別進(jìn)行濃縮，數(shù)字定量PCR和熒光PCR方法檢測后結(jié)果顯示每個樣品的病毒濃度差異不顯著，重復(fù)性較好。

與傳統(tǒng)的PCR方法相比，數(shù)字PCR方法更加靈敏，不需要依賴Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線而實現(xiàn)絕對核酸定量。近幾年，數(shù)字化PCR方法在動物疫病研究中也被廣泛應(yīng)用[18-20]，但是，數(shù)字PCR檢測成本較高，需要使用特定的數(shù)字PCR混合液、微滴生成油、微滴生成儀等試劑和檢測儀器，成本遠(yuǎn)高于熒光PCR 檢測方法。Jia等[21]比較了反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR(RT-ddPCR)與逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)2種方法對13個不同區(qū)域的傳染性造血器官壞死病毒毒株的測定。結(jié)果表明，反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR雖然檢測靈敏度與檢測范圍弱于反轉(zhuǎn)錄定量PCR，其相關(guān)性可達(dá)到69.40%以上。郝中香等[22]建立了針對鯉皰疹病毒2型的數(shù)字PCR檢測體系，結(jié)果顯示，數(shù)字PCR檢測靈敏度較熒光定量PCR高5倍，且重復(fù)性較好。趙欣等[23]也對鯉皰疹病毒Ⅱ型進(jìn)行進(jìn)一步研究，結(jié)果顯示，數(shù)字PCR及熒光定量PCR兩種方法線性關(guān)系和特異性均良好，但是數(shù)字PCR具有更好的重復(fù)性，并且臨床樣品檢測中，數(shù)字PCR較熒光定量PCR的陽性檢出率高，表明數(shù)字PCR技術(shù)在水生動物病毒檢測中具有一定前景。

對于整個蝦塘來說，對于蝦體進(jìn)行病毒檢測，樣品的代表性具有非常大的挑戰(zhàn)性。對于同一蝦池，發(fā)病情況也有不同，這主要是因為同一池蝦并不是來源于同一條親蝦，或蝦的個體免疫力差異的原因。而在實際檢測中無法做到每一條蝦都得到檢測，只能抽取一定數(shù)量的樣品，所以檢測結(jié)果就有可能存在偏差[24]。這種情況下，對蝦塘的水環(huán)境進(jìn)行病原檢測可以快速了解蝦的生長水環(huán)境中是否存在病原，可以在出現(xiàn)病毒量高引起蝦體死亡之前做出正確的生物安全措施，如隔離、消毒等，以減少損失。此外，這個方法還可以擴(kuò)展到了解蝦場、孵化場和水庫所采用的消毒方案的效力檢測。