張亞茹 ， 孫 偉 ， 鄭荷花 ， 王 沖 ， 盧國(guó)民 ， 肖大勇 ， 劉宗強(qiáng) ， 許 毅

(1. 山東新希望六和集團(tuán)有限公司 ， 山東 青島 266061 ； 2. 新希望六和股份有限公司 ， 山東 青島 266000)

水是家禽養(yǎng)殖過(guò)程中重要的營(yíng)養(yǎng)元素，一般家禽飲水量是采食量的2～3倍，但是養(yǎng)殖人員往往關(guān)注飼料問(wèn)題，而忽略了家禽飲水量是否充足，飲用水質(zhì)是否符合要求[1-2]，尤其容易忽略水質(zhì)管理問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，種禽場(chǎng)和商品雞場(chǎng)水源水和水線水都存在細(xì)菌污染的問(wèn)題[3-5]，一旦受細(xì)菌污染的水被家禽攝入體內(nèi)后，會(huì)引起腹瀉等腸道疾病，最終損害生產(chǎn)性能。另有研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場(chǎng)飲水給藥20周后，水線中仍然有抗菌藥殘留[6]，這將威脅食品安全。如何對(duì)水線細(xì)菌和抗菌藥殘留進(jìn)行有效控制成為家禽安全生產(chǎn)困擾的問(wèn)題之一。

常見(jiàn)的消毒劑如氯制劑等，對(duì)水線內(nèi)的微生物有良好的殺滅作用，但是對(duì)生物膜無(wú)明顯作用，細(xì)菌很容易再次滋生。另外消毒后的副產(chǎn)物具有致癌、致畸、致突變作用[7]，并且長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[8]。而臭氧作為強(qiáng)有效、作用快、無(wú)殘留的消毒劑，能夠殺滅細(xì)菌、病毒、芽孢等病原微生物。另外，臭氧能夠通過(guò)直接氧化和自由基間接氧化反應(yīng)與抗菌藥分子進(jìn)行作用[9-10]，氧化分解水線中殘留抗菌藥，已廣泛應(yīng)用于水處理和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。在養(yǎng)殖行業(yè)，研究表明利用臭氧處理水和飼料后飼喂肉雞，可以減少抗菌藥使用，改善料肉比，提高出欄只重[11]。但是關(guān)于臭氧在養(yǎng)殖行業(yè)水線處理方面的研究較少，本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究臭氧對(duì)養(yǎng)殖水線中細(xì)菌及抗菌藥的清除效果，為養(yǎng)殖行業(yè)的水線消毒處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由新希望六和動(dòng)保中心提供。

1.2 主要儀器 臭氧沖洗消毒機(jī)，購(gòu)自山東舍拜恩環(huán)?？萍加邢薰?；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；全溫振蕩搖床，購(gòu)自常州市國(guó)旺儀器制造有限公司；質(zhì)譜儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 試驗(yàn)處理

1.3.1 臭氧殺菌效果—實(shí)驗(yàn)室部分 為探究臭氧的殺菌消毒作用，挑選大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行復(fù)蘇，然后挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)24 h，取2 mL菌液加入200 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯搖4～6 h，用分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度后，將菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋至107、106、105、104、103CFU/mL，分別制備5 L菌液，組別為D1～D5。按照廠家說(shuō)明書(shū)將D1～D5組的5 L菌液分別通入到臭氧消毒機(jī)5 min進(jìn)行殺菌處理，處理后對(duì)應(yīng)組別為D1-1～D5-1。對(duì)處理前后的菌液使用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)比細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.3.2 臭氧殺菌效果—鴨場(chǎng)試驗(yàn)部分 選取同一棟處于空舍期的多層立體網(wǎng)養(yǎng)鴨舍(80 m×15 m)，配有乳頭式飲水系統(tǒng)。隨機(jī)選取12條水線，其中6條作為臭氧沖洗試驗(yàn)組(Ozone disinfection，OZD)，使用臭氧沖洗消毒機(jī)進(jìn)行沖洗消毒;另外6條作為對(duì)照組(Control，CON)，使用高壓沖洗法進(jìn)行水線清洗。在沖洗前，分別使用15 mL滅菌離心管，采集水源樣品3個(gè)、水線末端的樣品6個(gè)，臭氧沖洗消毒2、5 min和8 min后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采集水線末端樣品6個(gè)，對(duì)照組在同一時(shí)間點(diǎn)采集水線末端樣品6個(gè)。

觀察臭氧沖洗消毒前后水線中水質(zhì)渾濁程度變化；對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的沖洗前后水樣進(jìn)行細(xì)菌含量檢測(cè)，不同沖洗時(shí)間段的水樣進(jìn)行抗菌藥含量檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 參照 GB/T 5750.2—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集與保存》，用滅菌離心管采集鴨場(chǎng)水源和水線水的樣品，采集后4 ℃保存，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌和抗菌藥含量檢測(cè)。

細(xì)菌檢測(cè)指標(biāo)包括：菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。參照GB/T 5750.12—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》，分別使用平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行檢驗(yàn)；判別標(biāo)準(zhǔn)參照GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：菌落總數(shù)<100 CFU/mL判定為合格，100～1 000 CFU/mL為警告，>1 000 CFU/mL為超標(biāo)；大腸菌群不得檢出。

抗菌藥指標(biāo)包括：多西環(huán)素、氟苯尼考、痢菌凈、喹氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星。使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水樣中抗菌藥含量，所用儀器為Exactive 組合型四極桿 Orbitrap 質(zhì)譜儀。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，而不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)：Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 臭氧殺菌效果—實(shí)驗(yàn)室部分 從表1和圖1可以看出，消毒處理前培養(yǎng)基上均有大腸桿菌生長(zhǎng)，菌液濃度越高，細(xì)菌生長(zhǎng)越多；而臭氧試驗(yàn)組D1-1(處理前大腸桿菌的菌液濃度為107CFU/mL)，細(xì)菌生長(zhǎng)較多，其菌落計(jì)數(shù)超過(guò)1 000 CFU/mL，消毒后依然處于嚴(yán)重污染狀態(tài)；D2-1、D3-1、D4-1、D5-1只有零星大腸桿菌生長(zhǎng)，其數(shù)量不超過(guò)2 CFU/mL。因此，大腸桿菌的菌液濃度低于106CFU/mL時(shí)，臭氧的殺菌作用良好。

表1 大腸桿菌菌液在臭氧消毒前后的菌落計(jì)數(shù)情況Table 1 Escherichia coli colony counts before and after ozone disinfection (CFU/mL)

圖1 大腸桿菌菌液在臭氧消毒前后的細(xì)菌生長(zhǎng)情況Fig.1 Escherichia coli growth before and after ozone disinfectionD1～D5：處理前，其菌液濃度分別為107、106、105、104、103 CFU/mL; D1-1～D5-1：臭氧處理組，與D1～D5相對(duì)應(yīng)D1-D5:The untreated group，the concentration was 107,106,105,104,103 CFU/mL; D1-1-D5-1:Ozone disinfection group，corresponding to D1-D5

2.2 臭氧沖洗水線后水質(zhì)眼觀變化 從圖2可以看出，最初進(jìn)行水線沖洗時(shí)，水質(zhì)十分渾濁，含有大量的污染物，伴隨著沖洗時(shí)間的延長(zhǎng)，水中的絮狀雜質(zhì)逐漸減少，水質(zhì)由渾濁逐漸變?yōu)榍宄骸?/p>

圖2 水線經(jīng)過(guò)臭氧沖洗后水質(zhì)的眼觀變化Fig.2 Visual changes of water quality after ozone disinfection從左向右:分別為沖洗前、沖洗2、5 min和8 minFrom left to right: Before washing,after washing for 2,5 min and 8 min

2.3 臭氧沖洗消毒后水線中細(xì)菌含量變化 從表2可看出，水源水中菌落總數(shù)合格(<100 CFU /mL)，而大腸菌群數(shù)超標(biāo)；水線沖洗前菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)(>1 000 CFU/mL)，大腸菌群數(shù)也超標(biāo)。臭氧沖洗消毒后，與沖洗前比較，試驗(yàn)組水線的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)均顯著降低(P<0.05)，并且菌落總數(shù)降低了42倍，水線菌落總數(shù)從嚴(yán)重超標(biāo)降低到警告水平。而對(duì)照組進(jìn)行高壓沖洗后，與沖洗之前比較，水線的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)雖顯著降低(P<0.05)， 但其數(shù)值依然處于超標(biāo)水平，尤其是菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)。沖洗結(jié)束后，試驗(yàn)組菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 水線沖洗前后細(xì)菌含量變化情況Table 2 Changes of bacterial content in waterline before and after flushing (CFU/mL)

2.4 臭氧沖洗消毒前后水線中抗菌藥含量變化 從表3可以看出，水源水中無(wú)抗菌藥殘留，但是水線在沖洗前，除了無(wú)痢菌凈殘留之外，其他抗菌藥均有殘留，并且多西環(huán)素的殘留量高達(dá)21.8 μg/L和22.47 μg/L。沖洗2 min后，試驗(yàn)組氟苯尼考含量較沖洗前顯著降低(P<0.05)；8 min后，試驗(yàn)組多西環(huán)素、喹氟沙星和恩諾沙星含量較沖洗前顯著降低(P<0.05)，并且所測(cè)的抗菌藥均未檢出，臭氧沖洗對(duì)抗菌藥的清除效果為100%。而對(duì)照組進(jìn)行高壓沖洗8 min后，其水線中的抗菌藥較沖洗前也存在降低現(xiàn)象，尤其是多西環(huán)素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星的含量顯著降低(P<0.05)，其抗菌藥的清除效率為69.63%～88.92%，沖洗8 min后并不能完全清除水線中的抗菌藥。與對(duì)照組相比，沖洗8 min后，試驗(yàn)組水線中抗菌藥的含量顯著降低(P<0.05)，臭氧沖洗對(duì)抗菌藥的清除效果顯著優(yōu)于高壓沖洗。

表3 水線沖洗前后抗菌藥含量變化情況Table 3 Changes of antibiotic content in waterline before and after flushing (μg/L)

3 討論

家禽飼養(yǎng)過(guò)程中水質(zhì)安全問(wèn)題一直易被忽略，并且常規(guī)的水線消毒處理方式并不是很理想，本試驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室角度和肉鴨養(yǎng)殖使用場(chǎng)角度說(shuō)明了臭氧對(duì)水處理的良好效果，通過(guò)對(duì)水線進(jìn)行臭氧沖洗消毒，不僅能夠有效緩解水線中細(xì)菌污染情況，而且能夠完全清除水線中的抗菌藥殘留，是目前水線消毒處理的新型有效方法。

在對(duì)肉鴨場(chǎng)的水線進(jìn)行臭氧沖洗消毒過(guò)程中，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鴨舍內(nèi)水線的細(xì)菌污染程度很高，眼觀水質(zhì)渾濁程度的變化也說(shuō)明了水線污染嚴(yán)重(圖2)。本試驗(yàn)與袁東方等[3]、吳艷萍等[4]在商品雞場(chǎng)水質(zhì)的研究結(jié)果一致，說(shuō)明養(yǎng)殖場(chǎng)的水質(zhì)需要引起關(guān)注。這主要由于禽舍中的水線很容易形成生物膜，而在養(yǎng)殖過(guò)程中添加營(yíng)養(yǎng)藥、添加劑和抗菌藥等，會(huì)促使生物膜的形成，從而導(dǎo)致水線中的細(xì)菌進(jìn)一步滋生[12]，其中以大腸桿菌為主[13]。此外,生物膜的形成會(huì)降低藥物、疫苗接種的有效性，這提示養(yǎng)殖人員應(yīng)定期對(duì)飲水系統(tǒng)進(jìn)行清洗和消毒。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)高壓沖洗后，水線中的細(xì)菌總數(shù)含量顯著降低，消除效率達(dá)到84.62%，只是依然處于超標(biāo)的水平。而水線經(jīng)過(guò)臭氧消毒后，水線中的細(xì)菌含量顯著降低，從超標(biāo)降低至警告水平，消除效率達(dá)97.70%，說(shuō)明臭氧能有效殺滅水線中的細(xì)菌。臭氧消毒過(guò)程中水質(zhì)由渾濁變?yōu)榍宄?，也證實(shí)了臭氧沖洗消毒能夠有效去除生物膜。但是消毒結(jié)束后，水線中的水依然處于不合格狀態(tài)，可能因?yàn)樗x用的鴨場(chǎng)水線消毒管理不到位，細(xì)菌含量過(guò)高，同時(shí)水線長(zhǎng)度較長(zhǎng)，短時(shí)間內(nèi)不能將細(xì)菌有效清除，可以通過(guò)延長(zhǎng)沖洗消毒時(shí)間，多次沖洗直至水線中細(xì)菌含量合格為止。

近幾年，公眾對(duì)食品安全的關(guān)注度愈加上升，而水線中的抗菌藥殘留成為了食品安全的威脅之一。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水線中常用抗菌藥存在不同程度的殘留，尤其是多西環(huán)素殘留量最大，抗菌藥在水線中的殘留與Harn等的研究結(jié)果一致[6]。水線中多西環(huán)素含量為44.17 μg/L時(shí)，使用臭氧沖洗消毒水線8 min左右，水線中抗菌藥殘留清除率達(dá)到100%。這主要是由于臭氧沖洗消毒機(jī)能夠產(chǎn)生臭氧，采用脈沖式的沖洗方式，一方面能將附著在水線生物膜上的抗菌藥沉積物沖出水線，另一方面能夠通過(guò)直接氧化和自由基間接氧化反應(yīng)與抗菌藥分子進(jìn)行作用，將其分解轉(zhuǎn)化[9-10]，因此，臭氧能夠?qū)⑺€中的抗菌藥殘留有效消除。臭氧沖洗消毒降低了食品中多西環(huán)素、氟苯尼考、喹氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的藥殘風(fēng)險(xiǎn)，為食品安全提供了有效保障。

養(yǎng)殖場(chǎng)的水質(zhì)細(xì)菌污染嚴(yán)重，需要持續(xù)關(guān)注。定期進(jìn)行高壓沖洗，也能對(duì)水線達(dá)到一定的清理效果，但是細(xì)菌含量仍然很高，還需要對(duì)水線進(jìn)行消毒。而臭氧沖洗消毒不僅能夠從實(shí)驗(yàn)室角度實(shí)現(xiàn)良好的滅菌效果，而且在養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中殺菌效果好，且能夠有效清除水線中的抗菌藥殘留，操作簡(jiǎn)單、方便，可以考慮作為養(yǎng)殖場(chǎng)水線清洗消毒的常規(guī)方法。