劉春夢 董雪雯 吳佳俊 張富文

全球估計有4.63億人患有糖尿病[1]，而糖尿病性黃斑水腫(Diabetic macular edema,DME)是糖尿病患者中心視力喪失的主要原因[2]。DME是多種因素參與的復雜的病理生理過程。目前在臨床中抗VEGF治療是DME的一線治療，但其價格昂貴且需要反復給藥,還存在并發(fā)癥風險。此外，有接近50%的DME患者對這些治療反應不明顯或需要反復注射[3]。隨著人口老齡化，DME患者數(shù)量不斷增加，治療DME的眼科藥物開發(fā)的重點將是在降低治療成本的同時提高療效以及減少副作用[4]。中醫(yī)藥在治療DME方面具有豐富的經驗和獨特的優(yōu)勢，如長久維持視力改善，價格低廉，并減少反復眼內注射藥物的次數(shù)等。

芪燈明目膠囊是課題組研制的中藥復方制劑，以葛根為君，黃芪、燈盞細辛為臣，有養(yǎng)陰益氣、活血通絡的功效。目前臨床運用芪燈明目膠囊治療DME療效確切[5]，但由于中藥復方多成分多靶點的特點，其藥物活性物質及分子作用機制尚未完全明確。

網絡藥理學是藥物系統(tǒng)性研究的新興學科，強調從系統(tǒng)層次和生物網絡的整體角度出發(fā)，揭示藥物的系統(tǒng)性藥理機制[6]，從整體的角度去揭示藥物與疾病的關聯(lián)性，這與中醫(yī)藥整體觀與辨證論治的原則不謀而合[7]。本研究采用網絡藥理學的研究方法，探討芪燈明目膠囊治療DME的分子機制，以期為其臨床應用及后續(xù)研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1芪燈明目膠囊相關靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/)查詢芪燈明目膠囊3味中藥(黃芪，葛根，燈盞細辛)的所有化學成分，以口服利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%且類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18為篩選條件對活性成分進行篩選[8]，同時查閱2020年版《中華人民共和國藥典》以及國內外相關文獻，補充不符合上述篩選條件但認可度較高的有效成分。進一步通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選活性成分的潛在靶點，將結果導入Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)標準化蛋白質靶點信息。

1.2糖尿病性黃斑水腫相關靶點篩選 以糖尿病性黃斑水腫的英文名稱“Diabetic macular edema”為關鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、CTD(http://ctdbase.org/)中挖掘DME相關靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中靶點的Relevance score數(shù)值越高則表明靶點與疾病相關度越高，若靶點過多則設定Score大于10的靶點為DME的潛在靶點，合并4個疾病數(shù)據(jù)庫靶點并刪除重復值得到DME相關靶點。

1.3藥物-活性成分-靶點網絡圖構建 利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將芪燈明目膠囊與DME作用靶點取交集并繪制韋恩圖，得到芪燈明目膠囊治療DME的潛在靶點。將交集靶點與藥物活性成分一一對應后導入Cytoscape 3.7.2軟件建立“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，并對網絡進行拓撲學參數(shù)分析。

1.4PPI網絡構建 將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，生物種類限定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence>0.9”，其他均為默認值，去除游離節(jié)點，構建PPI網絡。將結果以“TSV”格式保存后，導入Cytoscape 3.7.2軟件中進行可視化分析，繪制PPI網絡圖。

1.5GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 通過David 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對芪燈明目膠囊治療DME的作用靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析，并利用R語言進行可視化。

1.6活性成分-靶點-通路網絡圖的構建 為了進一步研究芪燈明目膠囊治療DME的整體藥理機制，將與DME相關的通路、靶點以及中藥成分進行映射，運用Cytoscape 3.7.2軟件構建“活性成分-靶點-通路”網絡圖。

1.7分子對接驗證 將KEGG通路中P值排名靠前的通路所對應的靶點與PPI網絡的核心靶點取交集，選取度值前三的靶點作為核心受體，并反向篩選其對應的活性成分作為配體。從PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載配體的2D結構及3D結構SDF 格式文件。利用PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載靶點蛋白質結構，利用PyMol軟件除去水分子，分離原配體后保存。然后導入AutodockTools1.5.6軟件中進行加氫、確定受體活性口袋位置等處理后保存為“pdbqt”格式文件，利用Autodock-vina 1.1.2軟件進行分子對接，最后使用PyMol軟件進行可視化。

2 結果

2.1芪燈明目膠囊潛在活性成分的及其作用靶點篩選結果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫初步檢索到藥物活性成分共154個，其中黃芪87個、葛根18個、燈盞細辛49個。以OB%≥30%、DL≥0.18作為條件篩選后，得到潛在活性成分36個，其中黃芪20個、葛根4個、燈盞細辛12個。芒柄花黃素(MOL000392)為三藥共有成分，槲皮素(MOL000098)和山奈酚(MOL000422)為黃芪和燈盞細辛共有成分。并通過查閱文獻補充葛根相關活性成分葛根素[9]，見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢活性成分對應靶點并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范為基因名，分別得到黃芪、葛根及燈盞細辛作用靶點463、152、407個，整合去除重復值后為233個靶點。

表1 芪燈明目膠囊有效成分基本信息(OB≥30%，DL≥0.18)

2.2DME相關靶點獲取結果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得DME相關靶點2417個，靶點的Relevance score最大值為103.96，最小值為0.22，為提高結果的準確性，選取Relevance score≥10的靶點為DME的潛在靶點，共1081個。通過OMIM、CTD、TTD等數(shù)據(jù)庫分別獲得疾病相關靶點364、28、22個。整合刪除重復值后得到1041個DME相關靶點。

2.3藥物-活性成分-靶點網絡圖構建結果 利用Venny 2.1得到芪燈明目膠囊與DME交集靶點79個，見圖1。將交集靶點與活性成分進行映射，利用Cytoscape 3.7.2軟件建立“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，見圖2。對網絡圖進行拓撲學參數(shù)分析，其中節(jié)點度值(Degree)是衡量節(jié)點重要性的關鍵指標，網絡圖的平均度值為6.33，度值排名前五的化合物分別是槲皮素(MOL000098)、葛根素(MOL012297)、木犀草素(MOL000006)、山奈酚(MOL000422)和黃芩素(MOL002714)。度值排名前五的靶點是PTGS2、AR、NOS2、PPARG和ESR1。進一步證實了芪燈明目膠囊多成分、多靶點的特點。

圖1 芪燈明目膠囊活性成分靶點與DME靶點韋恩圖

圖2 芪燈明目膠囊治療DME的“藥物-活性成分-靶點”網絡

2.4PPI網絡構建結果 將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫初步得到蛋白質相互作用關系，再利用Cytoscape 3.7.2可視化，網絡圖共包含79個節(jié)點和1411條邊，節(jié)點顏色深淺根據(jù)其度值進行設定，節(jié)點顏色越深，其度值越大，見圖3。以節(jié)點的度值和介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)對節(jié)點的重要性進行評價[10]。節(jié)點的度值和BC的中位數(shù)分別為36和29.29，根據(jù)度值大于等于中位數(shù)且BC大于2倍中位數(shù)為篩選條件進行篩選，共得到20個靶點，如VEGFA、AKT1、PTGS2、MMP2、MMP9、ICAM1等。這些靶點可能是芪燈明目膠囊治療DME的核心靶點。

圖3 芪燈明目膠囊治療DME相關靶點PPI網絡

2.5GO功能富集分析與KEGG通路富集分析結果 GO功能富集分析涉及312個生物過程、38種細胞組分以及72項分子功能(P<0.05)。根據(jù)FDR值進行排序，用R語言對富集結果排名前10的GO條目進行可視化，見圖4。生物過程分析得知：靶標主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、血管生成、對藥物的應答、炎癥反應等生物過程。細胞組分分析可得知，這些靶標主要參與細胞外空間、膜筏、細胞表面、胞質等細胞組分。分子功能分析可得知，靶標主要影響酶結合、蛋白質結合、蛋白激酶活性及細胞因子活性等分子功能。

圖4 GO功能富集分析

KEGG通路富集得到99條信號通路(P<0.05)，取排名前20的條目繪制氣泡圖，見圖5。與DME有關的通路主要有VEGF 信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、胰島素抵抗等，表明芪燈明目膠囊作用于多條信號通路來治療糖尿病性黃斑水腫。

圖5 KEGG通路富集分析

2.6活性成分-靶點-通路網絡圖的構建結果 運用Cytoscape 3.7.2構建“活性成分-靶點-通路”網絡圖，見圖6。分析表明，網絡圖的平均度值為9.8，度值大于平均度值的活性成分共6個，預測為芪燈明目膠囊治療DME的核心成分，見表2。

圖6 活性成分-靶點-通路網絡圖

表2 芪燈明目膠囊治療DME的核心成分

2.7分子對接結果 為了驗證網絡的預測能力，將排名靠前通路對應的靶點與PPI網絡的核心靶點取交集，選取度值前三的靶點作為核心受體，包括VEGFA、AKT1、PTGS2。反向篩選其對應的活性成分，借助Autodock-vina1.1.2軟件進行分子對接，結果見表3。

表3 活性成分與靶點蛋白結合能

配體與受體結合越穩(wěn)定結合能越低，發(fā)生作用的可能性越大，結合能≤-5.0 kcal·mol-1說明兩者有較好的結合活性，≤-7.0 kcal·mol-1說明兩者有強的結合活性[11]。對接結果顯示，成分與其靶點的結合能均小于-6.0 kcal·mol-1，其中70%成分與其靶點的結合能≤-7.0 kcal·mol-1。根據(jù)結合能的大小將每個靶點蛋白對接最好的前2位化合物進行可視化，見圖7。以上對接的結果說明芪燈明目膠囊活性成分與其對應的核心靶點具有較好的結合活性，證明本研究的預測較為可靠。

圖7 分子對接結果3D示意圖

3 討論

DME的治療對于維持和改善患者的中心視力，提高生活質量具有重要的意義?，F(xiàn)目前DME的治療包括抗血管生成藥物、類固醇皮質激素、非甾體類消炎藥等藥物治療及激光治療、手術治療等。但都無法兼顧安全性、經濟性、臨床療效等方面。研究顯示，中藥聯(lián)合抗VEGF治療、激光光凝等療法能夠減輕黃斑區(qū)視網膜厚度，消除黃斑水腫；一些中藥制劑經研究證明也可以一定程度上緩解黃斑水腫[12-14]。我們在前期基礎藥理研究中發(fā)現(xiàn)，芪燈明目膠囊能通過降低STZ誘導糖尿病大鼠和GK自發(fā)糖尿病大鼠血清中的HIF-1α、VEGF、ANGⅡ的含量，抑制大鼠視網膜血管VEGF的表達，阻止視網膜組織PKC激活[15]，上調視網膜PEDF蛋白的表達[16]等，降低DR大鼠的視網膜微血管損害，保護血-視網膜屏障，降低視網膜微血管的滲漏[17]。目前臨床運用芪燈明目膠囊治療糖尿病性黃斑水腫療效確切，本研究采用網絡藥理學的研究方法，對芪燈明目膠囊治療DME的藥效物質、潛在作用靶點和作用通路進行深入探究。

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選以及查閱文獻補充后，共得到芪燈明目膠囊潛在活性成分37個。通過篩選得到對應作用靶點233個，DME相關靶點1041個，取交集后得到芪燈明目膠囊作用于DME的靶點79個。通過“藥物-活性成分-靶點”網絡圖初步篩選得到芪燈明目膠囊作用于DME的主要活性成分為槲皮素、葛根素、木犀草素、山奈酚和黃芩素等，這與“活性成分-靶點-通路”網絡圖篩選的結果一致。

PPI網絡結果顯示，VEGFA、AKT1、PTGS2、MMP2、MMP9、ICAM1等靶點具有較高的度值與介數(shù)中心性，處于網絡的中心位置。VEGFA[18]又稱血管通透因子，是血管內皮生長因子(VEGF)家族中最具特征成員，是血管生成過程最有效的刺激因子。VEGFA和其受體(VEGFR2)結合后將影響血管內皮的增殖、遷移、存活和通透性增加等，目前臨床上用于治療DME的抗VEGF藥物如雷珠單抗和貝伐單抗均是通過結合VEGFA而發(fā)揮作用[19]。AKT(又稱蛋白激酶B，PKB)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括AKT1-33種亞型，活化后的AKT和底物霉素靶體蛋白(mTOR)結合使其發(fā)生磷酸化，形成信號級聯(lián)反應，調節(jié)糖脂代謝、氧化應激、炎癥反應等，與DME的發(fā)生發(fā)展密切相關。PTGS2(又稱COX-2)，可將花生四烯酸轉化為促炎性前列腺素，并觸發(fā)其他促炎性趨化因子和細胞因子的產生，在炎癥反應中起著關鍵作用[20]，目前主要用于眼部手術后黃斑水腫的防治的非甾體類抗炎藥主要是通過抑制COX而發(fā)揮消炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用。MMP2、MMP9是基質金屬蛋白酶家族(MMPs)的重要成員，通過參與炎癥反應、新生血管生成以及線粒體功能障礙等影響DME的發(fā)生發(fā)展[21]，有研究表明增生性糖尿病視網膜病變患者玻璃體切除物中MMP2、MMP9的表達量增加[22]。ICAM1(細胞間黏附分子-1)可使白細胞粘附和聚集到視網膜血管內，導致血流紊亂和毛細血管無灌注，ICAM1與VEGF的表達呈正相關，二者發(fā)揮協(xié)同作用引起血管通透性增加，血視網膜屏障破壞，進而引起黃斑水腫[23-24]。這些靶點都與DME密切相關，芪燈明目膠囊通過這些靶點發(fā)揮治療DME的作用。

本研究進行了GO功能和KEGG通路富集分析，進一步說明這些關鍵作用靶點在基因功能和信號通路中的作用。結果表明芪燈明目膠囊可能參與血管生成、缺氧反應、炎癥反應等生物過程，在細胞外基質、細胞表面、細胞質、細胞核等部位發(fā)生蛋白質結合、蛋白磷酸酶結合、轉錄因子啟動等分子反應。進而調控VEGF、TNF、HIF-1、PI3K-Akt等信號通路發(fā)揮對DME的治療作用。這些通路可相互影響，相互作用共同參與DME的發(fā)生發(fā)展。慢性高血糖可導致視網膜血管閉塞和缺血缺氧，導致低氧誘導因子-1(HIF-1)含量增加[25]并啟動下游靶基因(如VEGF)的轉錄[26]。VEGF又進一步激活PI3K-Akt信號通路和基質金屬蛋白酶(MMPs)等誘導血管新生和增加血管通透性[27]。除了病理性的新生血管，炎癥反應在DME的發(fā)展中也起著重要作用，NF-kB可上調TNF-α的表達，上調的TNF-α進一步導致ICAM-1介導的異常白細胞黏附和內皮功能障礙，引起血-視網膜屏障的破壞，滲透性增加[28]。由此可見，芪燈明目膠囊可作用于多個生物學進程及多條通路而發(fā)揮治療DME的作用。

由活性成分-靶點-通路網絡可知槲皮素、山奈酚、葛根素、木犀草素、黃芩素等活性成分是芪燈明目膠囊的關鍵成分。槲皮素和山奈酚是黃芪和燈盞細辛的共有成分。研究表明槲皮素可抑制糖尿病大鼠視網膜caspase-3、TNF-a、NF-kB、AQP4等的表達，增加谷胱甘肽(GSH)、SOD、Bcl-2以及神經營養(yǎng)因子等的表達水平，可有效的保護糖尿病所致的視網膜神經變性、氧化應激、水腫以及炎癥[29-30]。山奈酚可改善胰島素抵抗，保護胰島β細胞，降低血糖血脂等而發(fā)揮治療糖尿病及并發(fā)癥的作用[31]。劉貴波等的研究結果表明山奈酚可上調IGF-1的表達，下調VEGF、MMP-2的表達水平而起到對糖尿病視網膜微血管病變的保護作用[32]。葛根素是葛根的有效活性成分之一，近年來發(fā)現(xiàn)葛根素在降低血糖和改善糖尿病并發(fā)癥方面具有確切的作用[33]。葛根素可抑制糖尿病大鼠視網膜AGEs的形成以及VEGF的表達[34]，減緩PEDF的下降[35]而起到保護保護糖尿病大鼠視網膜的作用。木犀草素和黃芩素是燈盞細辛的有效成分，木犀草素可預防胰島素抵抗以及發(fā)揮抗氧化作用從而保護糖尿病大鼠的視網膜[36-37]。黃芩素可改善鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病大鼠的小膠質細胞活化以及顯著降低視網膜的血管通透性[38]。為了驗證網絡藥理學預測結果的可靠性，利用分子對接技術考察了關鍵靶點與其對應的核心成分的結合活性。結果表明，芪燈明目膠囊的關鍵藥效成分與靶點蛋白結合能均-6.0 kcal·mol-1，其中葛根素與VEGFA、AKTI、PTGS2；木犀草素與AKTI、PTGS2；黃芩素與AKTI的結合能均小于-8.0 kcal·mol-1，表明這些成分和對應的靶點有較強的結合活性，推測這些活性成分在治療DME中發(fā)揮重要作用。

綜上，芪燈明目膠囊通過木犀草素、槲皮素、山奈酚、葛根素、黃芩素等活性成分作用于VEGFA、AKT1、PTGS2等關鍵靶點調節(jié)缺氧反應、血管生成、炎癥反應等生物過程，進而調控VEGF、HIF-1等多條信號通路發(fā)揮對DME的治療作用，本研究為芪燈明目膠囊的后續(xù)研究和臨床應用提供了理論依據(jù)。但檢索的數(shù)據(jù)庫還不夠全面，且僅限于網絡藥理學的內容，尚缺少實驗驗證，所以還需進行實驗進行驗證。