靖潔

作者單位：佳木斯市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002

肝癌是一種源自肝上皮組織或間葉組織的惡性腫瘤，發(fā)病率位于我國惡性腫瘤第3 位，病死率位于我國惡性腫瘤第2 位[1～3]。肝癌細胞生長活躍，易侵襲包膜和血管，出現(xiàn)局部擴散及遠處轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率高，化療耐藥性強，患者預(yù)后較差[4～6]，因此早期評估肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況是改善患者預(yù)后生存的關(guān)鍵。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類小型單鏈RNA 分子，具有高度保守、內(nèi)源性及非編碼的特點，長度為18～24 個核苷酸，在多個蛋白編碼基因表達環(huán)節(jié)中有著重要的調(diào)控作用，可參與調(diào)控癌細胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成等生物學過程[7～9]。miR-602、miR-452 為近期發(fā)現(xiàn)的miRNA，在胃癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌等實體惡性腫瘤中表達異常[10，11]，但其與肝癌的關(guān)系尚不明確。因此，本研究檢測miR-602、miR-452 在肝癌組織及癌旁正常組織中表達情況并分析其差異性，探討miR-602、miR-452表達與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床診治肝癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料經(jīng)本院倫理委員會批準，選取2014年12月～2018年12月在我院確診并行手術(shù)切除（R0 切除）的原發(fā)性肝癌患者72 例，術(shù)中收集癌組織及癌旁正常組織。入選標準：①患者經(jīng)術(shù)后病理學檢查確診，術(shù)前和術(shù)中探查均未見遠處轉(zhuǎn)移；②入院之前均未接受治療的初診患者；③病歷資料完整；④簽署知情同意書。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②依從性差；③合并心、肺、腎、腦等重要臟器疾?。虎芎喜⒕裣到y(tǒng)疾病。72 例肝癌患者中男54 例，女18 例；年齡30～78 歲，平均（58.82±6.49）歲；腫瘤直徑：＜5cm 33 例，≥5cm 39 例；分化程度：高分化45 例，中低分化27 例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期50例，Ⅲ期22 例。

1.2 研究方法

1.2.1 RT-PCR 法 用總RNA 提取試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司）提取所有患者癌組織及癌旁正常組織中的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR 擴增。PCR 擴增體系（總25μl）：cDNA 模板2.0μl，RNase H2O 9.5μl，SYBR Primix Ex Taq 12.5μl，Primer 1.0μl。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，93℃變性10s，61℃退火延伸30s，40 次循環(huán)。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，以2-△△Ct計算標準化后的miR-602、miR-452 表達水平，其中Ct 為循環(huán)閾值，內(nèi)參為GAPDH。

1.2.2 隨訪情況 采用電話及門診檢查相結(jié)合的方式進行隨訪，隨訪內(nèi)容包括超聲、CT、MRI、肝動脈造影等檢查。術(shù)后第1年每3 個月隨訪1 次，第2年開始每6 個月隨訪1 次，隨訪2年。記錄患者隨訪期間復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、存活情況。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗和Log-rank檢驗；采用Spearman 檢驗分析miR-602、miR-452 與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，ROC 曲線分析miR-602、miR-452 預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價值，COX 回歸模型及Kaplan-Meier 法分析miR-602、miR-452表達與肝癌術(shù)后預(yù)后的關(guān)系。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁正常組織中miR-602、miR-452相對表達量miR-602、miR-452 在肝癌組織中的相對表達量較癌旁正常組織顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 肝癌組織及癌旁正常組織中miR-602、miR-452相對表達量（±s）

表1 肝癌組織及癌旁正常組織中miR-602、miR-452相對表達量（±s）

組織nmiR-602miR-452癌旁正常組織720.76±0.160.45±0.07肝癌組織723.76±1.203.15±0.98 t 21.02723.318 P＜0.001＜0.001

2.2 未發(fā)生和發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者miR-602、miR-452相對表達量72 例患者術(shù)后隨訪2年，失訪8 例，其中未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者25 例，發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者39 例。發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者miR-602、miR-452相對表達量較未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表2。

表2 未發(fā)生和發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者miR-602、miR-452相對表達量（±s）

表2 未發(fā)生和發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者miR-602、miR-452相對表達量（±s）

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移nmiR-602miR-452未發(fā)生251.02±0.780.76±0.64發(fā)生394.12±1.473.77±1.15 t-10.978-13.422 P＜0.001＜0.001

2.3 Spearman 相關(guān)性分析miR-602、miR-452 均與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.501、0.548，P＜0.001）。

2.4 ROC 曲線分析miR-602、miR-452 單獨預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩個指標聯(lián)合預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價值明顯優(yōu)于各指標單獨預(yù)測（P＜0.05），見表3、圖1。

表3 miR-602、miR-452 預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價值

圖1 miR-602、miR-452 預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC 曲線

2.5 單因素和多因素COX 回歸分析72 例患者術(shù)后隨訪2年，失訪8 例，其中生存48 例，死亡16 例。COX 回歸分析顯示，臨床分期及miR-602、miR-452表達上調(diào)是肝癌術(shù)后預(yù)后的影響因素（P＜0.05），見表4。

表4 單因素和多因素COX 回歸分析肝癌術(shù)后預(yù)后影響因素

2.6 Kaplan-Meier 生存曲線分析miR-602 相對表達量＞3.51 患者肝癌術(shù)后2年病死率（31.23%）顯著高于miR-602 相對表達量≤3.51 患者（7.02%），Log-rank（χ2）=2.436，P=0.038。miR-452 相對表達量＞2.01 患者肝癌術(shù)后2年病死率（29.65%）顯著高于miR-452 相對表達量≤2.01 患者（10.15%），Log-rank（χ2）=3.321，P=0.017。見圖2。

圖2 不同miR-602、miR-452 表達水平患者生存曲線

3 討論

病毒性肝炎、酒精、尼古丁、黃曲霉素污染、有機氯農(nóng)藥、亞硝胺類物質(zhì)等為肝癌的危險因素，臨床中以食欲下降、消瘦乏力、餐后上腹飽脹及肝區(qū)疼痛為主要表現(xiàn)[12]。隨著人們生活及飲食方式的改變，肝癌發(fā)病率及死亡率呈較為明顯的增高趨勢[3]。手術(shù)治療的進步及放療、化療、分子靶向治療的不斷發(fā)展，使肝癌患者生存時間有所延長，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是臨床治療的難點問題[13]。因此，探究與肝癌發(fā)病及其進展有關(guān)的生物標志物具有重要意義。

miRNA 調(diào)控人體中1/3 左右的基因，在多種惡性腫瘤發(fā)病過程中具有關(guān)鍵作用，其與mRNA的非翻譯區(qū)結(jié)合，完全配對時可裂解mRNA，不完全配對時則可抑制mRNA 翻譯，引起相應(yīng)調(diào)控蛋白質(zhì)表達減少，導(dǎo)致疾病發(fā)生[14～16]。miRNA 可為促癌分子或抑癌分子，不同的miRNA 在相同或不同腫瘤中發(fā)揮著不同的效應(yīng)[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18～20]，miR-452 表達下調(diào)在膠質(zhì)瘤中能促進腫瘤細胞干性特征以及腫瘤形成；miR-452 敲減后乳腺癌細胞化療耐藥性顯著增加；miR-452 可靶向調(diào)控生存素（Survivin）表達來阻礙非小細胞肺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，最終抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。上述研究提示miR-452 在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，miR-452 在肝癌組織中呈高表達，并與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良呈正相關(guān)，提示miR-452 在肝癌中可能發(fā)揮促癌效應(yīng)，其促癌作用與以往的研究報道[21，22]相似，即miR-452 能夠靶向下調(diào)糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）水平，將無翅型MMTV 整合位點家族成員蛋白（Wnt）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路激活，造成胃癌細胞EMT；miR-452 在腎透明細胞癌患者癌組織中的表達量較癌旁正常組織增加約4 倍，它可能作為促癌基因參與了該疾病的發(fā)生。miR-602 為新發(fā)現(xiàn)的miRNA 之一，與細胞周期阻滯、血管生成及腫瘤形成等密切相關(guān)，miR-602在膽管癌中表達上調(diào)，可使該腫瘤細胞對化療藥物如卡培他濱、環(huán)磷酰胺等產(chǎn)生敏感性[23]。本研究中，miR-602 在肝癌組織中的相對表達量較癌旁正常組織顯著增加，提示miR-602 在肝癌組織中呈高表達，可能參與了肝癌的發(fā)生，與既往研究一致[24]，即乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）相關(guān)性肝癌患者癌組織中miR-602 表達較正常肝臟組織明顯上調(diào)，其表達量超過正常肝臟組織的2 倍以上，miR-602在HBV 感染至肝癌進程中具有重要作用。

此外，本研究顯示發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者miR-602、miR-452 相對表達量較未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者顯著增加，Spearman 相關(guān)性檢驗顯示miR-602、miR-452 與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。同時，COX 回歸分析顯示除臨床分期外，miR-602、miR-452 表達上調(diào)也是肝癌術(shù)后預(yù)后的影響因素；Kaplan-Meier分析顯示miR-602、miR-452 表達上調(diào)患者術(shù)后2年病死率顯著升高，提示miR-602、miR-452 與肝癌術(shù)后不良預(yù)后關(guān)系密切，miR-602、miR-452 對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后具有一定的預(yù)測作用。其機制可能為miR-602 靶向調(diào)控Ras 相關(guān)區(qū)域家族1A（Ras related region family 1A，RASSF1A）/Janus激酶（Janus kinase，JAK）通路，進而促進肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)。ROC 曲線分析顯示，miR-602、miR-452聯(lián)合預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC 為0.900，敏感性為92.35%，特異性為88.10%，提示miR-602＞3.51且miR-452＞2.01 時肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風險性較大，兩者聯(lián)合檢測對于肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測有較高的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，miR-602、miR-452 在肝癌組織中呈高表達，與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，有望成為肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后評估的候選臨床標志物。但本研究樣本量不足，隨訪觀察時間較短，且miR-602、miR-452 與肝癌之間的作用機制尚不明確，仍有待進一步研究。