魏鑫鑫 李曉玲 黃維平 尹中普

喉癌是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌最為多見，晚期多伴有呼吸困難，嚴(yán)重影響患者的生命健康［1］。喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)展過程與癌基因的表達(dá)、腫瘤細(xì)胞增殖和遷移關(guān)系密切，從基因角度對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程進(jìn)行深入研究，將有利于臨床的診療［2］。轉(zhuǎn)酮醇酶樣基因1（transketolase Like Protein 1，TKTL1）是磷酸戊糖（pentose phosphate pathway，PPP）途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，參與惡性腫瘤細(xì)胞的核酸合成過程；Wnt1 誘導(dǎo)分泌蛋白1（Wnt1 induced secreted protein-1，WISP-1）是Wnt 信號(hào)通路中藥的靶基因之一，與多種惡性腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切［3-4］，但目前有關(guān)TKTL1和WISP-1 在喉癌中的表達(dá)情況研究，報(bào)道較少。本研究將分析TKTL1和WISP-1 在喉鱗狀細(xì)胞癌患者病灶組織中的表達(dá)情況，并分析二者對(duì)患者預(yù)后的影響，以期為臨床喉鱗狀細(xì)胞癌的診斷、患者預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月至2018年3月于本院確診并接受手術(shù)治療的75 例喉鱗狀細(xì)胞癌患者為喉癌組，其中男68 例，女7 例，平均年齡（56.71±8.48）歲；腫瘤部位：聲門上區(qū)19 例，聲門區(qū)46 例，聲門下區(qū)10 例；組織分化：中低分化32 例，高分化43 例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期52 例，Ⅲ～Ⅳ期23 例；淋巴轉(zhuǎn)移18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①喉癌組患者臨床檢查符合喉鱗狀細(xì)胞癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，且均經(jīng)喉鏡、影像學(xué)及術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診；②患者性別不限，年齡≥18 歲；③既往無喉部手術(shù)史患者；④患者或家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②術(shù)前存在放化療治療史患者；③合并感染性疾病、重要臟器功能障礙和血液性疾病患者；④接受保守治療患者。另選取同期確診的聲帶息肉患者68 例為對(duì)照組，男62 例，女6 例，平均年齡（55.32±10.51）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組患者的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1TKTL1、WISP-1 表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組化EnVision 兩步法檢測(cè)組織TKTL1、WISP-1 陽性表達(dá)率。所有抗體、相關(guān)試劑購于北京博奧森生物工程有限公司、北京中杉金橋生物有限公司，嚴(yán)格按照相關(guān)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，雙盲法對(duì)TKTL1、WISP-1 細(xì)胞染色強(qiáng)度、陽性染色細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)估。其中，TKTL1陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒，WISP-1 陽性表現(xiàn)為細(xì)胞呈淡棕色或棕褐色。染色強(qiáng)度評(píng)分為：陰性=0 分，弱陽性=1 分，中等陽性=2 分，強(qiáng)陽性=3 分；陽性染色細(xì)胞數(shù)評(píng)分為：≤10%（0 分），11%～30%（1 分），31%～50%（2 分），＞50%（3 分）。二者總分≥3 時(shí)判斷為高表達(dá)，總分＜3 分時(shí)判斷為低表達(dá)［6］。

1.2.2TKTL1的mRNA 表達(dá)量和WISP-1 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

①TKTL1的mRNA 表達(dá)：采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)組織TKTL1的mRNA 表達(dá)量，熒光定量PCR 試劑盒（北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司）擴(kuò)增目 標(biāo) 基 因TKTL1，mRNA 表達(dá)結(jié)果采用2-ΔΔCt計(jì)算。②WISP-1 蛋白表達(dá)：采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織WISP-1 蛋白表達(dá)水平，BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，獲得蛋白表達(dá)量。

1.2.3 血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)

取患者術(shù)前3 d 晨起空腹肘靜脈血5 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清癌坯抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原199（Carbohydrate antigen199，CA199）表達(dá)水平。試劑盒購于北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 癌細(xì)胞增殖活力指標(biāo)檢測(cè)

采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)組織中增殖基因信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）、原癌基因c-myc的mRNA 表達(dá)量，檢測(cè)方法同1.2.2。

1.3 隨訪

采用電話、門診復(fù)查等方式對(duì)患者進(jìn)行為3年的隨訪，隨訪時(shí)間截至2021年3月。記錄患者的局部復(fù)發(fā)及死亡情況，統(tǒng)計(jì)TKTL1、WISP-1 不同表達(dá)強(qiáng)度患者3年病死率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 分析法；生存分析采用Kaplan-Meier 分析法；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者組織中TKTL1、WISP-1 陽性表達(dá)率比較

喉癌組TKTL1、WISP-1 陽性表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 TKTL1、WISP-1 在喉癌組織和息肉組織中的表達(dá)（SP×200）Figure 1 The expression of TKTL1 and WISP-1 in laryngeal carcinoma and polyp tissues（SP×200）

表1 兩組患者組織中TKTL1、WISP-1陽性表達(dá)率比較［n（%）］Table 1 Comparison of the positive expression rates of TKTL1 and WISP-1 between the two groups［n（%）］

2.2 兩組患者組織中TKTL1 的mRNA 表達(dá)量和WISP-1 蛋白表達(dá)水平比較

喉癌組患者的TKTL1mRNA 表達(dá)量和WISP-1蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者組織中TKTL1 的mRNA 表達(dá)量和WISP-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of TKTL1 mRNA and WISP-1 protein between the two groups（±s）

表2 兩組患者組織中TKTL1 的mRNA 表達(dá)量和WISP-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of TKTL1 mRNA and WISP-1 protein between the two groups（±s）

組別喉癌組對(duì)照組t 值P 值n 75 68 TKTL1 mRNA 1.93±0.64 0.48±0.09 18.512＜0.001 WISP-1 蛋白1.58±0.32 0.76±0.28 16.234＜0.001

2.3 兩組患者血清CEA、CA199 表達(dá)水平和增殖基因STAT3、c-myc 的mRNA 表達(dá)量比較

喉癌組患者的血清CEA、CA199 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，組織中增殖基因STAT3、c-myc的mRNA 表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者血清CEA、CA199 表達(dá)水平和增殖基因STAT3、c-myc 的mRNA 表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of the expression levels of serum CEA and CA199，and mRNA expression levels of proliferation genes STAT3 and c-myc between the two groups（±s）

表3 兩組患者血清CEA、CA199 表達(dá)水平和增殖基因STAT3、c-myc 的mRNA 表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of the expression levels of serum CEA and CA199，and mRNA expression levels of proliferation genes STAT3 and c-myc between the two groups（±s）

組別喉癌組對(duì)照組t 值P 值n 75 68 CEA（ng/L）9.31±1.86 3.42±1.07 22.898＜0.001 CA199（ng/L）30.78±9.74 13.58±3.65 13.712＜0.001 STAT3 mRNA 2.28±0.69 0.71±0.22 17.949＜0.001 c-myc mRNA 1.96±0.48 0.87±0.21 17.282＜0.001

2.4 TKTL1、WISP-1與CEA、CA199、STAT3 mRNA和c-myc mRNA 表達(dá)的相關(guān)性分析

患者TKTL1、WISP-1 的表達(dá)與CEA、CA199、STAT3 mRNA 和c-myc mRNA 表達(dá)均呈明顯正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表4 TKTL1、WISP-1 與CEA、CA199、STAT3 mRNA 和c-myc mRNA 表達(dá)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of TKTL1，WISP-1 and CEA，CA199，STAT3 mRNA and c-myc mRNA expression

2.5 TKTL1、WISP-1 表達(dá)對(duì)喉癌組患者預(yù)后的影響分析

TKTL1高表達(dá)患者3年累計(jì)生存率為51.16%，明顯低于TKTL1低表達(dá)患者的75.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.396，P=0.036）。WISP-1 高表達(dá)患者的3年累計(jì)生存率為55.32%，明顯低于WISP-1 低表達(dá)患者的71.43%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.055，P=0.044）。見圖2B。

圖2 喉癌組患者的總生存曲線Figure 2 Overall survival of patients in the laryngeal carcinoma group

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞的增殖分化與糖代謝密切相關(guān)，糖代謝中PPP 途徑非氧化支路產(chǎn)生的5-磷酸核糖是腫瘤細(xì)胞DNA 合成的重要原料，而TKTL1可增強(qiáng)PPP 通路活性，在促進(jìn)5-磷酸核糖生成的同時(shí)，產(chǎn)生大量乳酸使腫瘤周圍組織酸化，為腫瘤細(xì)胞的增殖分化提供適宜條件［7］。Wnt 信號(hào)通路異?；罨c喉癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，WISP-1作為Wnt 通路的靶基因，可激活核因子κB、粘附斑激酶及其信號(hào)通路，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組的TKTL1、WISP-1 陽性表達(dá)率均高于對(duì)照組，TKTL1mRNA 表達(dá)量和WISP-1蛋白表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組，提示TKTL1和WISP-1 可能在喉癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Li 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，TKTL1陽性表達(dá)率在食管鱗癌中升高，當(dāng)利用小干擾RNA 技術(shù)抑制TKTL1表達(dá)后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制。Wang 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，WISP-1 是微小RNA-384 的直接靶點(diǎn)，當(dāng)WISP-1 表達(dá)水平升高時(shí)，會(huì)解除因微小RNA-384過表達(dá)所導(dǎo)致的喉癌腫瘤細(xì)胞的抑制狀態(tài)，從而加速腫瘤細(xì)胞增殖。

CEA、CA199 是臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，可反映惡性腫瘤的侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［11］。本研究結(jié)果提示TKTL1、WISP-1 的表達(dá)水平可能與喉癌腫瘤細(xì)胞的活躍程度存在相關(guān)性。癌基因STAT3在多種腫瘤組織中異常激活，可通過調(diào)控包括c-myc在內(nèi)下游靶基因和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，發(fā)揮致癌作用，其表達(dá)水平變化可反映惡性腫瘤細(xì)胞的增殖情況［12］。本研究結(jié)果表明TKTL1、WISP-1 的表達(dá)可能參與了喉癌腫瘤細(xì)胞的增殖。沈敏等［13］在關(guān)于癌基因?qū)戆┙M織細(xì)胞增殖活力的影響研究中也發(fā)現(xiàn)，STAT3mRNA、c-mycmRNA 在喉癌患者中的表達(dá)量明顯高于聲帶息肉患者，并與某些癌基因表達(dá)呈正相關(guān)，認(rèn)為癌基因通過影響患者腫瘤細(xì)胞的增殖參與喉癌等的發(fā)生發(fā)展。分析原因可能是：①TKTL1在為喉癌腫瘤細(xì)胞提供核酸原料的同時(shí)，可顯著上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)血管新生，以協(xié)助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境，加速腫瘤細(xì)胞的增殖；②WISP-1可在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮原癌基因的作用，通過調(diào)控c-myc和G1/S-特異性周期蛋白-D1 的表達(dá)及信號(hào)通路，參與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［14-15］。本研究還發(fā)現(xiàn)，TKTL1、WISP-1 高表達(dá)患者的3年累計(jì)生存率明顯高于TKTL1、WISP-1 低表達(dá)患者，表明TKTL1、WISP-1 表達(dá)可影響患者的術(shù)后生存時(shí)間，二者在評(píng)估喉癌患者遠(yuǎn)期生存方面中具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，TKTL1、WISP-1 在喉癌患者病灶組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤標(biāo)志物、促癌基因的表達(dá)存在相關(guān)性，二者表達(dá)水平升高會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，影響患者的術(shù)后生存時(shí)間。