李哲濤 李伍高 唐永梅 秦祖興 唐妮 馮晶 唐寧

胚胎的形成和發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，受很多因素的影響，染色體的整倍性就是其中一個因素。胚胎染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常會影響胚胎的發(fā)育，影響胚胎的種植率，增加流產(chǎn)率及出生缺陷的風(fēng)險［1］。有研究顯示，體外培養(yǎng)的胚胎染色體非整倍體率接近60%［2］。隨著女方年齡的增大，染色體非整倍體的胚胎的比率也隨之增加［3］。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗的患者中，胚胎的染色體非整倍體也占有很高的比率［4-5］。植入前胚胎非整倍體遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A），是在胚胎植入前對胚胎染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測，并挑選染色體正常的胚胎植入子宮。通過該檢測有助于分析胚胎染色體的情況，減少無效的移植次數(shù)。本研究以需要借助輔助生殖技術(shù)的高齡、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗患者為研究對象，在高通量測序的平臺上對各指征患者進(jìn)行PGT-A，分析胚胎染色體非整倍體的情況，以了解各指征下胚胎染色體異常類型及分布情況，為臨床提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2018年1月-2019年12月期間于柳州市婦幼保健院生殖助孕健康中心就診患者共131例，根據(jù)《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查專家共識》［6］分為高齡組（女方年齡≥38 歲）69 例，年齡39～46 歲，平均（40.87±4.96）歲，非高齡組（女方年齡＜38 歲）62 例，年齡23～37 歲，平均（32.78±4.98）歲。將反復(fù)自然流產(chǎn)2 次以上的患者納入復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組共86 例，年齡23～46 歲，平均（35.59±5.03）歲，將移植3 次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數(shù)4～6 個或高評分囊胚數(shù)3 個及以上均失敗的患者納入反復(fù)種植失敗組共22 例，年齡34～44 歲，平均（38.23±4.21）歲。所有研究對象染色體核型分析均正常。該項目通過柳州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者行PGT-A 前簽署知情同意書。

1.2 囊胚活檢

采用常規(guī)長方案促排，于取卵后4 h 采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）進(jìn)行受精，16～18 h 后檢查受精情況，胚胎培養(yǎng)至囊胚期參考Gardner 評級系統(tǒng)［7］進(jìn)行評估，囊胚選擇標(biāo)準(zhǔn)為囊胚分期到達(dá)3 到5 期之間，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到達(dá)C 以上，外滋養(yǎng)層達(dá)到C 以上，認(rèn)為是可進(jìn)行囊胚活檢。

1.3 PGT-A 方法

將囊胚活檢的3～5 個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至PCR 管中，活檢細(xì)胞全基因組擴增采用植入前胚胎染色體非整倍體檢測試劑盒（貝瑞和康，中國）。胚胎高通量測序檢測使用CN500 測序平臺（Illumina 公司，美國），通過科孕安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（貝瑞和康，中國）對測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，質(zhì)控要求文庫濃度檢測濃度不小于10 ng/μL，原始數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾后的reads 數(shù)≥2.7 M，質(zhì)量值Q30 的堿基百分比≥80%，分析標(biāo)準(zhǔn)為Uniq reads≥1.5 M，對染色體進(jìn)行整倍體、微缺失及微重復(fù)的判讀。

1.4 分析指標(biāo)

分析胚胎染色體非整倍體率，若胚胎染色體上出現(xiàn)單體、三體、微缺失/微重復(fù)及嵌合的情況均定義為非整倍體胚胎，非整倍體胚胎率（%）=非整倍體胚胎數(shù)/活檢胚胎數(shù)×100%。分析高齡組與非高齡組的胚胎非整倍體率，為進(jìn)一步分析女方高齡的影響，分別在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組和反復(fù)種植失敗組中對高齡及非高齡女性進(jìn)行對比分析，同時比較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組和反復(fù)種植失敗組中胚胎異常類型情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用n（%）表示，行χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡分段患者間胚胎染色體非整倍體率比較

在女方高齡組中，胚胎非整倍體率為79.55%，顯著高于非高齡組（63.78%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.237，P＜0.001）。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組中，高齡女性胚胎非整倍體率為80.89%，顯著高于非高齡組（61.33%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.613，P＜0.001），但在反復(fù)種植失敗組中，非高齡組和高齡組胚胎非整倍體率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.833，P=0.362）。見表1。

表1 不同年齡之間胚胎情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of the rate of euploid and aneuploidy in different age groups of female［n（%）］

2.2 不同PGT-A 指征患者間胚胎異常類型比較

在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組中檢測出胚胎染色體的非整倍體率為67.49%，在反復(fù)種植失敗組中為73.55%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.657，P=0.198）。見表2。

表2 不同指征患者間染色體異常類型分布情況（n，%）Table 2 Distribution of abnormal types in chromosome with PGT-A indications（n，%）

3 討論

在體外受精-胚胎移植周期中，染色體異常是導(dǎo)致卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量下降的一個原因，在受精過程中，低質(zhì)量的卵母細(xì)胞會提高減數(shù)分裂的錯誤率，可能會導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯、胚胎植入失敗、流產(chǎn)率增加，以及懷孕期間出現(xiàn)并發(fā)癥的高風(fēng)險［8］。在輔助生殖領(lǐng)域，PGT-A 被認(rèn)為可以有效地提高妊娠率和活產(chǎn)率，特別是在高齡、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗的患者中［9］。染色體的狀態(tài)直接影響著胚胎的發(fā)育和移植，PGT-A 可以在高通量測序平臺上對植入前從胚胎中活檢的微量細(xì)胞的染色體拷貝數(shù)進(jìn)行分析，從而對胚胎進(jìn)行篩選，排除異常胚胎，選擇整倍體胚胎進(jìn)行移植［10］。本次研究共活檢囊胚719 例，檢測成功率為96.0%（690/719），其中整倍體胚胎為203 例（29.4%）。根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，具有PGT-A 指征的患者胚胎的整倍體率為33%［11］，結(jié)果略高于本研究的29.4%。大量的研究數(shù)據(jù)表明，隨著女性年齡的增長，胚胎非整倍體的比率也隨之升高［12］。在對高齡患者的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)女方年齡超過35 歲時，胚胎染色體異常率超過80%［13］。因此，本研究將所有病例分為高齡組和非高齡組進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示在高齡組中胚胎非整倍體率要明顯高于非高齡組?？梢?，在輔助生殖的高齡女性中，胚胎染色體異常是導(dǎo)致其不孕的主要因素。在對流產(chǎn)物組織的研究中發(fā)現(xiàn)，染色體異常率為58.19%［14］。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者中，胚胎染色體異常率為50.6%，且≥35 歲女性胚胎染色體異常比率高達(dá)80.8%［15］，這與本研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)相似。導(dǎo)致反復(fù)種植失敗的因素很多，胚胎染色體異常就是其中之一。研究發(fā)現(xiàn)，在反復(fù)種植失敗的患者中，連續(xù)兩個周期顯示有可移植的整倍體胚胎的女性具有較高的妊娠率，相反，在PGT-A 周期中沒有整倍體胚胎的患者在隨后的周期中也很難實現(xiàn)妊娠［16］。對于胚胎染色體非整倍體的機制目前仍未明確，有研究表明在高齡患者中，胚胎2 條及以上染色體異常在所有異常胚胎中所占的比例最高［3］。在流產(chǎn)組織的核型分析中，單條染色體異常最為常見，多條染色體異常所占的比例最少［17］。在對所有胚胎植入前遺傳學(xué)篩查指征下患者胚胎染色體非整倍體研究顯示，在染色體異常的胚胎中，以1 條和2 條染色體數(shù)目異常最為常見［18］。關(guān)于胚胎染色體的異常，主要包括整條染色體拷貝數(shù)的改變（單體，三體），染色體上大片段的缺失/重復(fù)，嵌合胚胎等。本文研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗的患者中，嵌合胚胎的比率較高，分別占41.8%和31.9%。胚胎的嵌合與活檢位置、活檢細(xì)胞數(shù)目、數(shù)據(jù)分析平臺等因素相關(guān)，在正常囊胚中，胚胎嵌合率高達(dá)3%～24%［19］。而本研究所納入的樣本均來自有PGT-A 臨床指征的患者，因此更進(jìn)一步提高了胚胎的異常比率，從而導(dǎo)致嵌合比率的增加。

綜上所述，在高齡、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗的患者胚胎中，染色體異常占有很大的比例。通過在二代測序的平臺，進(jìn)行PGT-A 可有效地避免染色體非整倍體的胚胎植入。