秦 旭 侯志云 張 松 馬 麗 朝浩鵬

1.北京市大興區(qū)人民醫(yī)院感染科 (北京， 102600) 2.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院檢驗科

慢性乙型肝炎(CHB)是由于機體感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝臟疾病，可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝癌，危及患者生命健康[1]。CHB發(fā)病機制尚未完全闡明，但有學者認為其發(fā)病進展與免疫反應、炎癥反應、糖鏈變化、細胞外基質(zhì)(ECM)合成/降解失衡等有關(guān)[2，3]。Mac-2結(jié)合蛋白糖基化異構(gòu)體(M2BPGi)是由肝星狀細胞合成的糖蛋白，其水平增加與CHB患者發(fā)生肝纖維化、肝細胞癌的高風險有關(guān)，M2BPGi可作為評估疾病進展的指標[4]。微纖維相關(guān)蛋白4(MFAP4)是一種ECM蛋白，其與CHB患者肝纖維化程度及肝組織炎癥活動分級相關(guān)，MFAP4可成為評估CHB進展的標志物[5]。但M2BPGi、MFAP4在不同程度CHB患者血清中的水平及與肝功能損傷指標的相關(guān)性鮮有研究，基于此，本研究通過檢測CHB患者血清M2BPGi、MFAP4水平，分析兩者與疾病進展的關(guān)系，以期為臨床評估CHB患者病情提供一定參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年4月至2019年4月在我院診治的84例CHB患者進行研究，稱CHB組，其中男性46例，女性38例；年齡35～65歲，平均(48.02±9.56)歲。并選取同期體檢正常者86例進行對照研究，稱健康組，其中男性47例，女性39例；年齡34～64歲，平均(47.97±9.18)歲。CHB組與健康組患者性別比例、年齡等資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。對CHB患者進行組織病理學檢測，采用Metavir評分系統(tǒng)對患者肝纖維化程度進行分期[6，7]，其中無纖維化組36例(F0期)、輕中度纖維化組26例(F1～F3期)、重度纖維化組22例(F4期)。

1.2 診斷標準 根據(jù)《CHB防治指南(2015年版)》有關(guān)CHB判定標準進行診斷[6]。

1.3 納入標準 ①符合CHB診斷標準；②經(jīng)病毒學、血清學、生化實驗指標檢查確診；③對本項研究均知情同意。所有受試者或其直系親屬簽署知情同意書，本研究符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會審核、批準。

1.4 排除標準 ①合并人類免疫缺陷病毒、丙型、丁型肝炎病毒感染者；②合并免疫性肝病、酒精肝、藥物性肝病等其他慢性肝臟疾病者；③合并嚴重心、肺、腎等器官疾病者；④妊娠哺乳期女性；⑤合并精神智力障礙者。

1.5 主要試劑與儀器 人M2BPGi酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒(貨號：062831)購買于YAD；人MFAP4 ELISA試劑盒(貨號：E-EL-H0581)購買于ELABS，HBV DNA檢測試劑盒(貨號：11585614910)購買于ROCHE公司；酶標儀(型號：SpectraMax iD3)購買于Molecular Devices；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號：ABI 7500Fast)購買于Thermofisher。

1.6 樣本收集 收集所有研究對象空腹外周血6～7 ml，室溫下自然凝集，4 800 r/min離心5 min，收集上層血清，分裝于無菌EP管中，于-80℃冰箱中保存。

1.7 ELISA法檢測血清M2BPGi、MFAP4水平 按照人M2BPGi、MFAP4 ELISA試劑盒說明書配制一系列濃度的標準樣品，利用酶標儀檢測不同濃度標準品在450 nm處的吸光度，繪制標準品回歸曲線。取適量凍存血清樣本，解凍，測定樣本在450 nm處的吸光度值，根據(jù)標準回歸曲線計算血清M2BPGi、MFAP4濃度。

1.8 HBV DNA水平檢測 采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA水平，程序參數(shù)設置為：93℃ 1 min，1個循環(huán)；93℃ 45 s，55℃ 45 s，30個循環(huán)，于55℃ 45 s時采集熒光，最低檢測下限100 IU/ml。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清M2BPGi、MFAP4水平比較 與健康組相比，CHB組患者血清M2BPGi、MFAP4水平均顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 兩組患者血清M2BPGi、MFAP4水平比較

2.2 不同病情程度CHB患者血清M2BPGi、MFAP4、ALT、AST、HBV DNA、LSM、Alb水平比較 與無纖維化組相比，輕中度、重度纖維化組患者血清M2BPGi、MFAP4、ALT、AST水平及HBV DNA水平均顯著升高(P<0.05)；與輕中度纖維化組相比，重度纖維化組患者血清M2BPGi、MFAP4、ALT、AST水平及HBV DNA水平均顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.3 CHB患者血清M2BPGi、MFAP4水平與ALT、AST、HBV DNA、LSM、Alb關(guān)系 Pearson法分析顯示，CHB患者血清M2BPGi、MFAP4水平與ALT、AST、HBV DNA水平及LSM均呈正相關(guān)(P<0.05)，與Alb呈負相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表2 不同病情程度CHB患者血清M2BPGi、MFAP4、ALT、AST、HBV DNA、LSM、Alb水平比較

表3 CHB患者血清M2BPGi、MFAP4水平與ALT、AST、HBV DNA、LSM、Alb相關(guān)性

2.4 CHB患者血清M2BPGi水平與MFAP4的相關(guān)性 Pearson法分析顯示，CHB患者血清M2BPGi水平與MFAP4水平呈正相關(guān)(r=0.462，P<0.05)，見圖1。

圖1 CHB患者血清M2BPGi水平與MFAP4的關(guān)系

2.5 CHB患者發(fā)生肝纖維化的影響因素 以CHB患者是否發(fā)生肝纖維化(發(fā)生=1，不發(fā)生=0)，以M2BPGi、MFAP4、ALT、AST、HBV DNA、LSM、Alb等為自變量納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，M2BPGi、MFAP4、ALT、AST、HBV DNA、LSM均是影響CHB患者發(fā)生肝纖維化的危險因素(P<0.05)，Alb是影響CHB患者發(fā)生肝纖維化的保護因素(P<0.05)，見表4。

表4 Logistic回歸分析CHB患者發(fā)生肝纖維化的影響因素

3 討論

CHB是臨床常見的一種慢性肝臟疾病，腹脹、惡心、乏力、肝區(qū)疼痛等為主要臨床特征，其不僅損害肝臟功能，還可侵犯心臟、腎臟等器官，引起多器官病變，對患者生存質(zhì)量構(gòu)成嚴重威脅[8]。因此，尋找CHB發(fā)病的影響因素，及時監(jiān)控，對改善患者生活質(zhì)量有一定積極意義。

糖鏈在疾病發(fā)展及生命進程中發(fā)揮著特異性識別、介導、調(diào)控信號轉(zhuǎn)導作用，糖鏈結(jié)構(gòu)改變可引起感染性疾病、腫瘤的發(fā)生，可反映細胞功能改變、分化、肝纖維化進展等情況[9]。既往研究顯示，Mac-2結(jié)合蛋白(M2BP)是一類可存在于血漿、胞漿、組織液中的N型糖基化蛋白，其在傳染病、炎癥性疾病、癌癥中水平明顯升高，其可作為肝纖維化、肝癌的生物標志物[10]。另有研究顯示，紫藤凝集素陽性M2BP(WFA+M2BP)是一種糖基化蛋白，其可預測CHB患者肝纖維化[11]。此外，M2BPGi是M2BP的糖鏈異構(gòu)體，楊以良等[12]認為隨著丙型肝炎肝纖維化加重，M2BP在表達水平及結(jié)構(gòu)上發(fā)生明顯變化，但其敏感性較差，而M2BPGi在肝臟病變中有較強特異性，可更好反映肝纖維進程。以上研究表明，糖鏈異常與肝臟病變密切相關(guān)。血清M2BPGi水平與CHB患者發(fā)生肝細胞癌的風險呈正相關(guān)，其參與CHB病理發(fā)展過程，M2BPGi可作為獨立預測肝細胞癌的因子[13]。本研究中CHB組患者血清M2BPGi水平明顯高于健康組，且M2BPGi水平隨CHB病情加重呈上升趨勢，提示M2BPGi可能在CHB發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有利于評估CHB患者病情，推測M2BPGi糖鏈中含有大量N聚糖，其水平升高，調(diào)節(jié)細胞免疫、信號轉(zhuǎn)導，從而CHB促進發(fā)病過程。

MFAP4是先天免疫模式識別分子，含有C-末端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域及N -端整合素結(jié)合序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列)，作為細胞受體整合素配體參與細胞間的相互作用及細胞黏附[14]。MFAP4作為ECM重要成分，其可與不同膠原蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，此結(jié)合有鈣依賴性[5]，其水平降低可抑制嗜酸性粒細胞炎癥作用、氣道重塑，MFAP4在哮喘中水平升高，與局部嗜酸性粒細胞趨化因子水平相關(guān)，其在哮喘疾病發(fā)展中發(fā)揮促進作用[15]。Bracht等[16]通過對542例丙型肝炎患者進行回顧性分析，結(jié)果顯示，MFAP4在丙型肝炎患者中水平異常，其可作為評估肝纖維化程度的生物學標志物，且抗病毒治療后，血清MFAP4水平降低，肝纖維化程度降低，MFAP4有助于判定丙型肝炎患者病情進展[17]。以上研究表明，MFAP4可能在免疫炎癥類疾病中起重要作用。本研究中CHB組患者血清MFAP4水平明顯高于健康組，且CHB疾病越嚴重，MFAP4水平升高越明顯，提示MFAP4可能與CHB疾病進展關(guān)系密切，究其原因，可能是MFAP4水平升高促進其鈣依賴性地與膠原蛋白結(jié)合，促進炎癥反應和ECM轉(zhuǎn)化[5]，從而促進CHB發(fā)展。

HBV感染機體后，易引發(fā)肝損害，導致CHB患者血清ALT、AST、Alb水平變化，三者水平均可一定程度反映CHB患者肝損傷程度[18，19]；HBV DNA是HBV復制的主體，其水平與肝損傷嚴重程度呈正比，可直接反映CHB感染情況[20]；且LSM有利于評估CHB患者肝纖維化程度[21]。本研究中CHB患者血清ALT、AST、HBV DNA、LSM水平隨CHB疾病加重而升高，ALB水平隨CHB疾病加重而降低，提示ALT、AST、HBV DNA、LSM、ALB可能在CHB發(fā)展中有重要作用，三者可有效地反映CHB進展及肝損傷情況。本研究中CHB患者血清M2BPGi、MFAP4水平與ALT、AST、HBV DNA、LSM水平均呈正相關(guān)，與ALB呈負相關(guān)，提示M2BPGi、MFAP4可能與肝功能、HBV感染相互影響，從而協(xié)同影響CHB發(fā)展。進一步研究顯示，CHB患者血清M2BPGi水平與MFAP4水平呈正相關(guān)，M2BPGi可能與MFAP4相互作用，進而影響信號轉(zhuǎn)導、免疫炎癥反應，從而共同促進CHB發(fā)展，但具體作用機制有待深入探究。此外，M2BPGi、MFAP4、ALT、AST、HBV DNA、LSM均是影響CHB患者發(fā)生肝纖維化的危險因素，Alb是影響CHB患者發(fā)生肝纖維化的保護因素，提示血清M2BPGi、MFAP4、ALT、AST、HBV DNA水平及LSM升高，血清Alb水平降低均可能會增加CHB患者發(fā)生肝纖維化風險，及時監(jiān)測上述指標，有助于臨床及時防治肝纖維化。

綜上所述，M2BPGi、MFAP4在CHB患者血清中水平升高，兩者可能相互影響，從而共同在CHB發(fā)展中起重要作用，檢測兩者水平有助于判定CHB患者病情。但本研究未將CHB患者纖維化細分，未深入探究M2BPGi、MFAP4關(guān)系，后續(xù)將增加樣本量深入研究。