楊守親 古春凌 張碩峰 林 怡 彭 超 吳曉玲 徐 暢 孫千惠 楊智文 高小峰 程 凱
(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)
內(nèi)關(guān)穴作為心律失常的常用穴,古文獻(xiàn)記載[1]及現(xiàn)代臨床[2]都已證實其在治療心系病中有著特異性優(yōu)勢。在影響針效的因素中,針刺深度和刺激參數(shù)都發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,程莘農(nóng)院士認(rèn)為甚至可以起到直接決定作用[3]?!端貑枴ご桃摗分小安∮懈〕?,刺有淺深,各有至理,無過其道”。已認(rèn)識到穴位層次對療效的差異。楊繼洲則將穴位層次與補(bǔ)瀉手法相結(jié)合,并以此來區(qū)分刺激量的輕重,提出“刺有大小”的理論。而現(xiàn)代關(guān)于穴位層次和刺激量的研究多集中于單一因素[4]。針刺深度上,已有文獻(xiàn)主要分為兩種觀點“深刺優(yōu)于淺刺”[5-6]及“深淺刺療效無差別”[7]。而兩種觀點不一致的原因是否在于沒有對刺激量加以把控?且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[8],不同頻率電針存在刺激效應(yīng)的差異。因此,本課題將兩因素綜合考慮,采用心血管疾病中常見的2、20、100 Hz[9-10]作為低中高頻代表;并為防止電流耗損、層次疊加效應(yīng),采用只在針尖處放電的絕緣針作為施術(shù)針具,觀察兩因素對家兔心律失常在心肌形態(tài)和鈉鉀泵功能上的影響。
1.1 實驗動物 新西蘭雄性大耳白兔52只,體質(zhì)量2.0~2.5 kg,3月齡。購自北京富龍騰飛養(yǎng)殖中心,許可證號:SCXK(京)2018-0009,于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房正常飼養(yǎng)。實驗前將家兔用剃毛器剔除左前肢前臂內(nèi)側(cè)面兔毛,以準(zhǔn)確取穴。此過程中對家兔的操作均符合科技部頒布《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。
1.2 試劑與儀器 水合氯醛(北京虹湖化工,B861682-100 g),氯化鋇(北京虹湖化工,C804539-100 g),BL-420N生物信號采集分析系統(tǒng)(成都泰盟),絕緣針(無錫佳健,直徑0.3 mm×13 mm、針尖裸露3 mm,針身專利納米涂層),華佗SDZ-V電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠),EG1150H石蠟包埋機(jī)(德國Leica),正置顯微鏡(德國尼康),Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自動生化分析儀(美國),超微量Na+-K+-ATPase測定試劑盒(Na+-K+-ATPase assay kit RGB&CHN Lot:20210622.40041)
1.3 分組與造模 將家兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、淺層組(2、20、100 Hz)、深層組(2、20、100 Hz)共8組,排除造模死亡和造模之前已有心律失常家兔剩48只,每組各6只。家兔稱重后,按體質(zhì)量0.5 g∕kg腹腔給藥水合氯醛。家兔麻醉后,腹面朝上固定在兔臺上,用一次性針灸針刺入家兔四肢遠(yuǎn)節(jié)皮下,針柄處連接BL-420N三頭電極,紅色接右前肢、黑色接右后肢、綠色接左后肢,選擇ECG模式。觀測心電5 min,剔除先天有心律失常的家兔??瞻捉M經(jīng)耳緣靜脈快速推注(4 s)0.9%氯化鈉溶液(1 mL∕kg)。模型組及治療組則快速推注0.4%氯化鋇溶液(1 mL∕kg),以給藥后示波器出現(xiàn)連續(xù)寬大畸形的QRS波群為造模成功[11]。
1.4 干預(yù)方法 各治療組造模成功后即刻取內(nèi)關(guān)穴,定位參照《實驗針灸學(xué)》[12]標(biāo)準(zhǔn),于家兔左前肢內(nèi)側(cè)下1∕6折點處(約在腕關(guān)節(jié)上1.1 cm)、腕橈側(cè)屈肌與指淺屈肌之間。淺層組[13]用0.3 mm×13 mm絕緣針直刺3 mm,確認(rèn)刺入淺筋膜層且針尖止于肌肉表面后,用同樣的方法在內(nèi)關(guān)穴上3 mm處采用同樣的進(jìn)針深度刺入第二根絕緣針,接通電針儀,連續(xù)波,持續(xù)20 min,頻率根據(jù)組別分別選 2、20、100 Hz;深層組[13]直刺內(nèi)關(guān)穴5~8 mm,適當(dāng)調(diào)整針尖方向以觸發(fā)正中神經(jīng)出現(xiàn)過電樣抽搐為度,余操作同淺層組。
1.5 觀察指標(biāo) 1)心律失常持續(xù)時間。家兔麻醉后,ECG持續(xù)監(jiān)測心電活動直至恢復(fù)竇性心律持續(xù)300 s,視為大致恢復(fù)正常心電圖[14]。以造模成功后第一個寬大畸形的Q波為開始時間,以大致恢復(fù)正常心電圖的第一個竇性P波為結(jié)束時間。2)心肌組織形態(tài)。觀測結(jié)束后,在家兔麻醉尚未蘇醒的情況下(若有蘇醒,則按體質(zhì)量0.5 g∕kg腹腔注射水合氯醛),剪開左側(cè)胸骨剪斷心底部血管,并取左心室前壁心肌一分為二,一份置于10%甲醛溶液固定1周左右,經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片(厚度4 μm)后,用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色,置于顯微鏡下觀察。3)心肌組織Na+-K+-ATP酶濃度。左心室前壁心肌另一份留存于凍存管并置于-80℃冰箱備用待測。取樣本按照1∶10體積比加入生理鹽水進(jìn)行勻漿,每組樣本設(shè)對照管進(jìn)行酶促反應(yīng)、定磷、再按照總蛋白測定試劑盒說明加入1 mL工作液,混勻,37℃水浴10 min,546 nm波長,空白管(蒸餾水)調(diào)零,標(biāo)準(zhǔn)液定標(biāo),測定每份樣品的總蛋白濃度,具體操作參照說明書進(jìn)行。
1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SAS9.2統(tǒng)計軟件。計量資料以(x±s)表示,兩組數(shù)據(jù)均正態(tài)且方差齊時,用獨立t檢驗;3組及以上用單因素方差分析;分析兩因素交互作用時用(2×3)析因分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組家兔心律失常持續(xù)時間比較 與空白組相比,其余各組均出現(xiàn)心律失常,以室性心動過速(VT)或室顫(VF)為主,提示心律失常建模成功。與模型組比較,2 Hz淺層組無統(tǒng)計學(xué)差異,其余治療組持續(xù)時間均有縮短(P<0.05),其中20 Hz深層組能顯著縮短持續(xù)時間(P<0.01)。各治療組之間,20 Hz深層組<2 Hz深層組<100 Hz深層組<20 Hz淺層組<100 Hz淺層組<2 Hz淺層組,見表1,圖1。
表1 各組家兔心律失常持續(xù)時間比較(min,±s)
表1 各組家兔心律失常持續(xù)時間比較(min,±s)
注:與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下同。
組別空白組模型組2 Hz淺層組20 Hz淺層組100 Hz淺層組2 Hz深層組20 Hz深層組100 Hz深層組死亡(n) 使用(n) 持續(xù)時間0△△69.36±3.72 64.56±4.58 32.14±3.94△49.33±3.56△27.89±3.34△21.12±2.34△△30.58±4.77△0 2 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6 6 6 6 6
圖1 各組家兔心律失常持續(xù)時間的比較(±s)
2.2 各組心肌病理形態(tài)學(xué)比較 空白組鏡下觀察心肌細(xì)胞呈長帶狀,細(xì)胞核1~2個,形似橢圓或長方形,核周染色淺。肌原纖維排列整齊,周期性橫紋清晰。細(xì)胞之間有規(guī)則的閏盤連接。模型組心肌切面肌纖維排列紊亂,嗜酸性增強(qiáng),間質(zhì)中有紅細(xì)胞滲出,閏盤增厚,并可見到大量空泡,細(xì)胞核腫大。2 Hz淺層組、100 Hz淺層組可見到肌纖維明顯紊亂,閏盤增厚,細(xì)胞核腫大;20 Hz淺層、2 Hz深層、100 Hz深層可見肌原纖維排列不整齊,細(xì)胞核腫大,可見個別空泡樣改變。20 Hz深層組心肌纖維基本排列整齊,邊緣清晰,未見滲出,見圖2。
圖2 各組家兔心肌病理變化(HE,200倍)
2.3 各組家兔心肌組織中Na+-K+-ATP酶濃度比較與空白組比較,模型組心肌Na+-K+-ATP酶值降低(P<0.05)。20 Hz淺層組及2、20、100 Hz深層組與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。
表2 各組家兔心肌Na+-K+-ATP濃度比較(U∕mg,±s)
表2 各組家兔心肌Na+-K+-ATP濃度比較(U∕mg,±s)
組別空白組模型組2 Hz淺層組20 Hz淺層組100 Hz淺層組2 Hz深層組20 Hz深層組100 Hz深層組死亡(n) 使用(n)0 6 2 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6 Na+-K+-ATP 6.818±0.466△4.588±0.510 4.670±0.509 5.940±0.684△4.616±0.455 5.906±0.845△6.625±1.432△5.913±0.723△
氯化鋇以其操作簡單、可重復(fù)性好的優(yōu)點常作為誘發(fā)心律失常藥物。給予家兔4 mg∕kg,心律失常持續(xù)時間穩(wěn)定在(69.36±3.72)min,類型主要為VT或VF,與報道一致[11]。
心律失常可引起心肌缺血缺氧,引起胞內(nèi)脂肪酸β-氧化以及糖酵解產(chǎn)生有害的氫離子[15],改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,因此HE染色出現(xiàn)嗜酸性增強(qiáng)的表現(xiàn);滲透壓增高,則導(dǎo)致心肌細(xì)胞腫大。研究表明[16],心肌缺血不僅累及心肌纖維,還影響細(xì)胞間閏盤結(jié)構(gòu)。正如模型組切片所見,心肌間隙增寬,閏盤增厚,而各治療組都有不同程度的改善。心律失常發(fā)生時常伴隨、Na+、K+、Ca2+流向的改變[17]。而心肌中Na+-K+-ATP酶能通過水解ATP逆胞膜兩側(cè)電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運(yùn)Na+、K+,來達(dá)到改變電位差對抗心律失常;而當(dāng)酶活性受抑制時,膜兩側(cè)離子可出現(xiàn)異常分布,引起Ca2+超載進(jìn)而損傷心肌結(jié)構(gòu)[18]。本結(jié)果表明,模型組Na+-K+-ATP酶值下降明顯,引起膜兩側(cè)離子流發(fā)生改變,出現(xiàn)了嚴(yán)重的心律失常,結(jié)合HE染色可知,鈣超載引起部分胞膜發(fā)生破裂出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。治療組除2、100 Hz淺層外,酶活性有不同程度地提高,心律失常持續(xù)時間也有縮短,提示電針內(nèi)關(guān)穴對抗心律失常的作用途徑可能與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶活性有關(guān)。
古人認(rèn)為針刺取效在于調(diào)氣,疾病所在部位層次不同決定了同一穴針刺深度不同。如《靈樞·九針十二原》強(qiáng)調(diào)“刺之要,氣至而有效”,還提到“疾淺針深,內(nèi)傷良肉……淺深不得,反為大賊”。針刺深度超過疾病所在層次可能會導(dǎo)致?lián)p傷,并提出五體(皮脈肉筋骨)辨病定位依據(jù)以及對應(yīng)的五種針刺深度;到了近現(xiàn)代,程莘農(nóng)院士[3]提出“三才針法”將針刺深度進(jìn)一步具體化。學(xué)者們逐漸意識到針刺深度不同存在刺激效應(yīng)的差異,并推測穴位各層次上組織結(jié)構(gòu)分布不同是差異產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。如崔氏[19]發(fā)現(xiàn),淺深刺能分別提高慢性炎性痛大鼠不同種類疼痛的閾值,并推測其與穴位淺深層次上神經(jīng)支配、化學(xué)特征等不同有關(guān)。內(nèi)關(guān)穴是一個立體的三維空間結(jié)構(gòu),針刺深度不同所刺激到的感受器不同。研究認(rèn)為[20],內(nèi)關(guān)穴調(diào)節(jié)心律失常主要與正中神經(jīng)有關(guān)。基于此,我們前期觀察了[13]內(nèi)關(guān)穴淺層針深3 mm不觸及正中神經(jīng)對家兔心律失常的影響并與深層5~8 mm觸及正中神經(jīng)進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),內(nèi)關(guān)穴淺層同樣有對抗心律失常的作用,且淺深層次不存在效應(yīng)差異。但此操作過程中未對刺激參數(shù)進(jìn)行把控,而刺激參數(shù)也會對針刺效應(yīng)產(chǎn)生影響。《靈樞》將針刺手法分虛實從側(cè)面表明靈素時期已經(jīng)認(rèn)識到刺激量大小的差異。楊繼洲、徐鳳等具體描述不同手法并用于治療不同性質(zhì)的疾病。近代石學(xué)敏院士[21]將手法進(jìn)行了量學(xué)規(guī)范。電針取代傳統(tǒng)手法具有客觀、穩(wěn)定持久的優(yōu)點常用于臨床和科研研究中,其同樣存在量學(xué)差異。賈萍[22]以3、20、100 Hz為低、中、高頻代表觀察對家兔胃節(jié)律亢進(jìn)的效果,結(jié)果20 Hz電針表現(xiàn)最優(yōu)。其原因可能與神經(jīng)體液分泌有關(guān),但確切機(jī)制還尚待證實。陳凌[9]的研究采用同樣的低中高頻觀察對烏頭堿誘發(fā)的心律失常的影響,20 Hz中頻表現(xiàn)最佳并推測其作用機(jī)制可能與通過抑制Na+內(nèi)流,延遲有效不應(yīng)期、保護(hù)心肌減少炎性反應(yīng)等有關(guān)。針刺鎮(zhèn)痛領(lǐng)域?qū)Σ町愋詸C(jī)制研究較多,并已證實不同頻率對腦區(qū)中核團(tuán)有所偏好,脈沖頻率對激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)肽類物質(zhì)釋放有關(guān)鍵性作用[23]。
本課題以心血管疾病中常見的電針頻率2、20、100 Hz作為低、中、高頻代表并結(jié)合內(nèi)關(guān)穴淺深層次來觀察比較對心律失常模型的影響,結(jié)果提示:1)內(nèi)關(guān)穴淺深層均可對抗心律失常,且深層略優(yōu)于淺層;這說明內(nèi)關(guān)穴對抗心律失常不但與深層的正中神經(jīng)有關(guān),淺層也存在負(fù)責(zé)傳導(dǎo)針刺信號的通道。結(jié)合穴位解剖層次分析,可能與游離神經(jīng)末梢、環(huán)層小體或橈神經(jīng)淺支或交感神經(jīng)節(jié)后纖維等感受器密切相關(guān)。張承舜[24]在健康男性內(nèi)關(guān)穴淺深刺對神經(jīng)傳導(dǎo)影響研究中,指出淺刺信號可能主要由前臂內(nèi)、外側(cè)皮神經(jīng)傳導(dǎo),深刺則主要為正中神經(jīng)。且淺深刺神經(jīng)傳導(dǎo)無顯著性差異,但淺刺產(chǎn)生的波幅低于深刺,可能與兩種刺激條件下興奮的運(yùn)動纖維數(shù)量、類別不同有關(guān)。本研究觀察到深層效果略優(yōu)于淺層,可能與深層可直接興奮正中神經(jīng),并通過調(diào)控外周神經(jīng)活動改善自主神經(jīng)活性來對抗心律失常有關(guān);而淺層雖存在針刺信號傳導(dǎo)途徑但在神經(jīng)調(diào)節(jié)中對運(yùn)動纖維數(shù)量興奮較少,傳達(dá)出的刺激信號強(qiáng)度弱于深層。2)從電針頻率影響作用上看,低頻2 Hz產(chǎn)生的刺激效應(yīng)較弱甚至是無;隨頻率增加,刺激效應(yīng)逐漸增加;當(dāng)刺激量增大到一定程度時,效應(yīng)增加趨勢有所減緩。臨床上將超出疾病所需閾值的刺激量稱為“無效治療量”[25],超出部分并不會使刺激效應(yīng)增大而提高療效,甚至可能帶來不必要的損傷[26]。穴位淺深層次上呈現(xiàn)同樣的趨勢,提示針對具體疾病,電針存在適宜頻率,不及和過強(qiáng)都不能發(fā)揮穴位的最佳效應(yīng)。下一步可增加研究頻率的分布密度,繪制出大致的量效曲線圖以便直觀地反映頻率與刺激效應(yīng)之間關(guān)系。近年來出現(xiàn)了只刺激穴位淺層的新興針法和理論如符氏浮針[27]、腕踝針[28]等逐漸得到學(xué)界認(rèn)可,且患者易于接受并取得滿意療效。國外如日本針灸界追求輕刺激,推行“淺刺”“細(xì)針”“套管針”,受到患者的歡迎[29]。筆者認(rèn)為臨床上面對具體疾病時,在考慮獲得最佳療效的同時,也應(yīng)平衡患者感受,一味追求強(qiáng)刺激可能會引起患者情緒緊張導(dǎo)致機(jī)體機(jī)能狀態(tài)發(fā)生改變進(jìn)而影響療效。過強(qiáng)的刺激可能還會帶來不必要的損傷引發(fā)患者抵觸心理影響醫(yī)患配合度,同樣也會對針效產(chǎn)生折扣。
綜上所述,穴位效應(yīng)的發(fā)揮與針刺深度、刺激頻率密切相關(guān),因此對量效關(guān)系的研究也應(yīng)考慮二者關(guān)系。目前大多數(shù)研究將二者進(jìn)行單因素分析可能一定程度上會使結(jié)論片面,對影響因素多重考慮才能更貼近臨床實際,更好地為臨床提供參考。