楊守親 古春凌 張碩峰 林 怡 彭 超 吳曉玲 徐 暢 孫千惠 楊智文 高小峰 程 凱

（北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

內(nèi)關(guān)穴作為心律失常的常用穴，古文獻記載[1]及現(xiàn)代臨床[2]都已證實其在治療心系病中有著特異性優(yōu)勢。在影響針效的因素中，針刺深度和刺激參數(shù)都發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，程莘農(nóng)院士認為甚至可以起到直接決定作用[3]?！端貑枴ご桃摗分小安∮懈〕粒逃袦\深，各有至理，無過其道”。已認識到穴位層次對療效的差異。楊繼洲則將穴位層次與補瀉手法相結(jié)合，并以此來區(qū)分刺激量的輕重，提出“刺有大小”的理論。而現(xiàn)代關(guān)于穴位層次和刺激量的研究多集中于單一因素[4]。針刺深度上，已有文獻主要分為兩種觀點“深刺優(yōu)于淺刺”[5-6]及“深淺刺療效無差別”[7]。而兩種觀點不一致的原因是否在于沒有對刺激量加以把控？且有學者發(fā)現(xiàn)[8]，不同頻率電針存在刺激效應的差異。因此，本課題將兩因素綜合考慮，采用心血管疾病中常見的2、20、100 Hz[9-10]作為低中高頻代表；并為防止電流耗損、層次疊加效應，采用只在針尖處放電的絕緣針作為施術(shù)針具，觀察兩因素對家兔心律失常在心肌形態(tài)和鈉鉀泵功能上的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭雄性大耳白兔52只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，3月齡。購自北京富龍騰飛養(yǎng)殖中心，許可證號：SCXK（京）2018-0009，于北京中醫(yī)藥大學動物房正常飼養(yǎng)。實驗前將家兔用剃毛器剔除左前肢前臂內(nèi)側(cè)面兔毛，以準確取穴。此過程中對家兔的操作均符合科技部頒布《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 試劑與儀器 水合氯醛（北京虹湖化工，B861682-100 g），氯化鋇（北京虹湖化工，C804539-100 g），BL-420N生物信號采集分析系統(tǒng)（成都泰盟），絕緣針（無錫佳健，直徑0.3 mm×13 mm、針尖裸露3 mm，針身專利納米涂層），華佗SDZ-V電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠），EG1150H石蠟包埋機（德國Leica），正置顯微鏡（德國尼康），Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自動生化分析儀（美國），超微量Na+-K+-ATPase測定試劑盒（Na+-K+-ATPase assay kit RGB&CHN Lot：20210622.40041）

1.3 分組與造模 將家兔按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、淺層組（2、20、100 Hz）、深層組（2、20、100 Hz）共8組，排除造模死亡和造模之前已有心律失常家兔剩48只，每組各6只。家兔稱重后，按體質(zhì)量0.5 g∕kg腹腔給藥水合氯醛。家兔麻醉后，腹面朝上固定在兔臺上，用一次性針灸針刺入家兔四肢遠節(jié)皮下，針柄處連接BL-420N三頭電極，紅色接右前肢、黑色接右后肢、綠色接左后肢，選擇ECG模式。觀測心電5 min，剔除先天有心律失常的家兔?？瞻捉M經(jīng)耳緣靜脈快速推注（4 s）0.9%氯化鈉溶液（1 mL∕kg）。模型組及治療組則快速推注0.4%氯化鋇溶液（1 mL∕kg），以給藥后示波器出現(xiàn)連續(xù)寬大畸形的QRS波群為造模成功[11]。

1.4 干預方法 各治療組造模成功后即刻取內(nèi)關(guān)穴，定位參照《實驗針灸學》[12]標準，于家兔左前肢內(nèi)側(cè)下1∕6折點處（約在腕關(guān)節(jié)上1.1 cm）、腕橈側(cè)屈肌與指淺屈肌之間。淺層組[13]用0.3 mm×13 mm絕緣針直刺3 mm，確認刺入淺筋膜層且針尖止于肌肉表面后，用同樣的方法在內(nèi)關(guān)穴上3 mm處采用同樣的進針深度刺入第二根絕緣針，接通電針儀，連續(xù)波，持續(xù)20 min，頻率根據(jù)組別分別選 2、20、100 Hz；深層組[13]直刺內(nèi)關(guān)穴5～8 mm，適當調(diào)整針尖方向以觸發(fā)正中神經(jīng)出現(xiàn)過電樣抽搐為度，余操作同淺層組。

1.5 觀察指標 1）心律失常持續(xù)時間。家兔麻醉后，ECG持續(xù)監(jiān)測心電活動直至恢復竇性心律持續(xù)300 s，視為大致恢復正常心電圖[14]。以造模成功后第一個寬大畸形的Q波為開始時間，以大致恢復正常心電圖的第一個竇性P波為結(jié)束時間。2）心肌組織形態(tài)。觀測結(jié)束后，在家兔麻醉尚未蘇醒的情況下（若有蘇醒，則按體質(zhì)量0.5 g∕kg腹腔注射水合氯醛），剪開左側(cè)胸骨剪斷心底部血管，并取左心室前壁心肌一分為二，一份置于10%甲醛溶液固定1周左右，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片（厚度4 μm）后，用蘇木精-伊紅進行染色，置于顯微鏡下觀察。3）心肌組織Na+-K+-ATP酶濃度。左心室前壁心肌另一份留存于凍存管并置于-80℃冰箱備用待測。取樣本按照1∶10體積比加入生理鹽水進行勻漿，每組樣本設(shè)對照管進行酶促反應、定磷、再按照總蛋白測定試劑盒說明加入1 mL工作液，混勻，37℃水浴10 min，546 nm波長，空白管（蒸餾水）調(diào)零，標準液定標，測定每份樣品的總蛋白濃度，具體操作參照說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SAS9.2統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)均正態(tài)且方差齊時，用獨立t檢驗；3組及以上用單因素方差分析；分析兩因素交互作用時用（2×3）析因分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔心律失常持續(xù)時間比較 與空白組相比，其余各組均出現(xiàn)心律失常，以室性心動過速（VT）或室顫（VF）為主，提示心律失常建模成功。與模型組比較，2 Hz淺層組無統(tǒng)計學差異，其余治療組持續(xù)時間均有縮短（P＜0.05），其中20 Hz深層組能顯著縮短持續(xù)時間（P＜0.01）。各治療組之間，20 Hz深層組＜2 Hz深層組＜100 Hz深層組＜20 Hz淺層組＜100 Hz淺層組＜2 Hz淺層組，見表1，圖1。

表1 各組家兔心律失常持續(xù)時間比較（min，±s）

表1 各組家兔心律失常持續(xù)時間比較（min，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組2 Hz淺層組20 Hz淺層組100 Hz淺層組2 Hz深層組20 Hz深層組100 Hz深層組死亡（n） 使用（n） 持續(xù)時間0△△69.36±3.72 64.56±4.58 32.14±3.94△49.33±3.56△27.89±3.34△21.12±2.34△△30.58±4.77△0 2 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6 6 6 6 6

圖1 各組家兔心律失常持續(xù)時間的比較（±s）

2.2 各組心肌病理形態(tài)學比較 空白組鏡下觀察心肌細胞呈長帶狀，細胞核1～2個，形似橢圓或長方形，核周染色淺。肌原纖維排列整齊，周期性橫紋清晰。細胞之間有規(guī)則的閏盤連接。模型組心肌切面肌纖維排列紊亂，嗜酸性增強，間質(zhì)中有紅細胞滲出，閏盤增厚，并可見到大量空泡，細胞核腫大。2 Hz淺層組、100 Hz淺層組可見到肌纖維明顯紊亂，閏盤增厚，細胞核腫大；20 Hz淺層、2 Hz深層、100 Hz深層可見肌原纖維排列不整齊，細胞核腫大，可見個別空泡樣改變。20 Hz深層組心肌纖維基本排列整齊，邊緣清晰，未見滲出，見圖2。

圖2 各組家兔心肌病理變化（HE，200倍）

2.3 各組家兔心肌組織中Na+-K+-ATP酶濃度比較與空白組比較，模型組心肌Na+-K+-ATP酶值降低（P＜0.05）。20 Hz淺層組及2、20、100 Hz深層組與模型組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。見表2。

表2 各組家兔心肌Na+-K+-ATP濃度比較（U∕mg，±s）

表2 各組家兔心肌Na+-K+-ATP濃度比較（U∕mg，±s）

組別空白組模型組2 Hz淺層組20 Hz淺層組100 Hz淺層組2 Hz深層組20 Hz深層組100 Hz深層組死亡（n） 使用（n）0 6 2 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6 Na+-K+-ATP 6.818±0.466△4.588±0.510 4.670±0.509 5.940±0.684△4.616±0.455 5.906±0.845△6.625±1.432△5.913±0.723△

3 討 論

氯化鋇以其操作簡單、可重復性好的優(yōu)點常作為誘發(fā)心律失常藥物。給予家兔4 mg∕kg，心律失常持續(xù)時間穩(wěn)定在（69.36±3.72）min，類型主要為VT或VF，與報道一致[11]。

心律失?？梢鹦募∪毖毖酰鸢麅?nèi)脂肪酸β-氧化以及糖酵解產(chǎn)生有害的氫離子[15]，改變細胞內(nèi)環(huán)境，因此HE染色出現(xiàn)嗜酸性增強的表現(xiàn)；滲透壓增高，則導致心肌細胞腫大。研究表明[16]，心肌缺血不僅累及心肌纖維，還影響細胞間閏盤結(jié)構(gòu)。正如模型組切片所見，心肌間隙增寬，閏盤增厚，而各治療組都有不同程度的改善。心律失常發(fā)生時常伴隨、Na+、K+、Ca2+流向的改變[17]。而心肌中Na+-K+-ATP酶能通過水解ATP逆胞膜兩側(cè)電化學梯度轉(zhuǎn)運Na+、K+，來達到改變電位差對抗心律失常；而當酶活性受抑制時，膜兩側(cè)離子可出現(xiàn)異常分布，引起Ca2+超載進而損傷心肌結(jié)構(gòu)[18]。本結(jié)果表明，模型組Na+-K+-ATP酶值下降明顯，引起膜兩側(cè)離子流發(fā)生改變，出現(xiàn)了嚴重的心律失常，結(jié)合HE染色可知，鈣超載引起部分胞膜發(fā)生破裂出現(xiàn)細胞結(jié)構(gòu)改變。治療組除2、100 Hz淺層外，酶活性有不同程度地提高，心律失常持續(xù)時間也有縮短，提示電針內(nèi)關(guān)穴對抗心律失常的作用途徑可能與調(diào)節(jié)心肌細胞膜上的Na+-K+-ATP酶活性有關(guān)。

古人認為針刺取效在于調(diào)氣，疾病所在部位層次不同決定了同一穴針刺深度不同。如《靈樞·九針十二原》強調(diào)“刺之要，氣至而有效”，還提到“疾淺針深，內(nèi)傷良肉……淺深不得，反為大賊”。針刺深度超過疾病所在層次可能會導致?lián)p傷，并提出五體（皮脈肉筋骨）辨病定位依據(jù)以及對應的五種針刺深度；到了近現(xiàn)代，程莘農(nóng)院士[3]提出“三才針法”將針刺深度進一步具體化。學者們逐漸意識到針刺深度不同存在刺激效應的差異，并推測穴位各層次上組織結(jié)構(gòu)分布不同是差異產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。如崔氏[19]發(fā)現(xiàn)，淺深刺能分別提高慢性炎性痛大鼠不同種類疼痛的閾值，并推測其與穴位淺深層次上神經(jīng)支配、化學特征等不同有關(guān)。內(nèi)關(guān)穴是一個立體的三維空間結(jié)構(gòu)，針刺深度不同所刺激到的感受器不同。研究認為[20]，內(nèi)關(guān)穴調(diào)節(jié)心律失常主要與正中神經(jīng)有關(guān)?；诖耍覀兦捌谟^察了[13]內(nèi)關(guān)穴淺層針深3 mm不觸及正中神經(jīng)對家兔心律失常的影響并與深層5～8 mm觸及正中神經(jīng)進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)關(guān)穴淺層同樣有對抗心律失常的作用，且淺深層次不存在效應差異。但此操作過程中未對刺激參數(shù)進行把控，而刺激參數(shù)也會對針刺效應產(chǎn)生影響?！鹅`樞》將針刺手法分虛實從側(cè)面表明靈素時期已經(jīng)認識到刺激量大小的差異。楊繼洲、徐鳳等具體描述不同手法并用于治療不同性質(zhì)的疾病。近代石學敏院士[21]將手法進行了量學規(guī)范。電針取代傳統(tǒng)手法具有客觀、穩(wěn)定持久的優(yōu)點常用于臨床和科研研究中，其同樣存在量學差異。賈萍[22]以3、20、100 Hz為低、中、高頻代表觀察對家兔胃節(jié)律亢進的效果，結(jié)果20 Hz電針表現(xiàn)最優(yōu)。其原因可能與神經(jīng)體液分泌有關(guān)，但確切機制還尚待證實。陳凌[9]的研究采用同樣的低中高頻觀察對烏頭堿誘發(fā)的心律失常的影響，20 Hz中頻表現(xiàn)最佳并推測其作用機制可能與通過抑制Na+內(nèi)流，延遲有效不應期、保護心肌減少炎性反應等有關(guān)。針刺鎮(zhèn)痛領(lǐng)域?qū)Σ町愋詸C制研究較多，并已證實不同頻率對腦區(qū)中核團有所偏好，脈沖頻率對激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)肽類物質(zhì)釋放有關(guān)鍵性作用[23]。

本課題以心血管疾病中常見的電針頻率2、20、100 Hz作為低、中、高頻代表并結(jié)合內(nèi)關(guān)穴淺深層次來觀察比較對心律失常模型的影響，結(jié)果提示：1）內(nèi)關(guān)穴淺深層均可對抗心律失常，且深層略優(yōu)于淺層；這說明內(nèi)關(guān)穴對抗心律失常不但與深層的正中神經(jīng)有關(guān)，淺層也存在負責傳導針刺信號的通道。結(jié)合穴位解剖層次分析，可能與游離神經(jīng)末梢、環(huán)層小體或橈神經(jīng)淺支或交感神經(jīng)節(jié)后纖維等感受器密切相關(guān)。張承舜[24]在健康男性內(nèi)關(guān)穴淺深刺對神經(jīng)傳導影響研究中，指出淺刺信號可能主要由前臂內(nèi)、外側(cè)皮神經(jīng)傳導，深刺則主要為正中神經(jīng)。且淺深刺神經(jīng)傳導無顯著性差異，但淺刺產(chǎn)生的波幅低于深刺，可能與兩種刺激條件下興奮的運動纖維數(shù)量、類別不同有關(guān)。本研究觀察到深層效果略優(yōu)于淺層，可能與深層可直接興奮正中神經(jīng)，并通過調(diào)控外周神經(jīng)活動改善自主神經(jīng)活性來對抗心律失常有關(guān)；而淺層雖存在針刺信號傳導途徑但在神經(jīng)調(diào)節(jié)中對運動纖維數(shù)量興奮較少，傳達出的刺激信號強度弱于深層。2）從電針頻率影響作用上看，低頻2 Hz產(chǎn)生的刺激效應較弱甚至是無；隨頻率增加，刺激效應逐漸增加；當刺激量增大到一定程度時，效應增加趨勢有所減緩。臨床上將超出疾病所需閾值的刺激量稱為“無效治療量”[25]，超出部分并不會使刺激效應增大而提高療效，甚至可能帶來不必要的損傷[26]。穴位淺深層次上呈現(xiàn)同樣的趨勢，提示針對具體疾病，電針存在適宜頻率，不及和過強都不能發(fā)揮穴位的最佳效應。下一步可增加研究頻率的分布密度，繪制出大致的量效曲線圖以便直觀地反映頻率與刺激效應之間關(guān)系。近年來出現(xiàn)了只刺激穴位淺層的新興針法和理論如符氏浮針[27]、腕踝針[28]等逐漸得到學界認可，且患者易于接受并取得滿意療效。國外如日本針灸界追求輕刺激，推行“淺刺”“細針”“套管針”，受到患者的歡迎[29]。筆者認為臨床上面對具體疾病時，在考慮獲得最佳療效的同時，也應平衡患者感受，一味追求強刺激可能會引起患者情緒緊張導致機體機能狀態(tài)發(fā)生改變進而影響療效。過強的刺激可能還會帶來不必要的損傷引發(fā)患者抵觸心理影響醫(yī)患配合度，同樣也會對針效產(chǎn)生折扣。

綜上所述，穴位效應的發(fā)揮與針刺深度、刺激頻率密切相關(guān)，因此對量效關(guān)系的研究也應考慮二者關(guān)系。目前大多數(shù)研究將二者進行單因素分析可能一定程度上會使結(jié)論片面，對影響因素多重考慮才能更貼近臨床實際，更好地為臨床提供參考。