劉赟 曹芳 夏凡童 閆杰 趙強

神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma）是起源于原始神經(jīng)嵴細胞的胚胎性惡性腫瘤，是5 歲以下兒童最常見的顱外實體腫瘤，占小兒惡性腫瘤的8%～10%，占兒童惡性腫瘤死亡率的15%，被稱為兒童腫瘤之王[1]。高危神經(jīng)母細胞瘤患兒的特征包括：年齡＞18 個月；臨床分期出現(xiàn)遠端轉(zhuǎn)移；病理分型為未分化型；MYCN擴增；染色體11q 的節(jié)段性丟失[2]。MYCN 擴增是神經(jīng)母細胞瘤最重要的促癌因素之一，約20%的神經(jīng)母細胞瘤和40%的高危組患兒有MYCN 擴增，其與神經(jīng)母細胞瘤的預后密切相關(guān)[3]。高危組患兒占整體神經(jīng)母細胞瘤患兒60%以上，其5年生存率低于30%，隨著治療方案的進步以及綜合治療的開展，許多兒童腫瘤的預后明顯改善，但高危神經(jīng)母細胞瘤患兒的預后仍不盡人意，仍有50%患兒可能出現(xiàn)復發(fā)[4]。因此目前亟待提出更加有效的臨床預后指標，以及時的給予其更有效的治療，從而改善高危神經(jīng)母細胞瘤患兒的預后。

長鏈非編碼RNA（lncRNAs）通常被定義為超過200 個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本。雖然75%的人類基因組中的基因可以轉(zhuǎn)錄成RNA，然而其中僅約2%的RNA 可以編碼蛋白，提示大部分的RNA 是以非編碼的形式存在，并且非編碼RNA 可能在生物進化過程中具有重要意義[5-6]。lncRNA 與多種生物學功能相關(guān)[7]，包括轉(zhuǎn)錄干擾、端粒維持、細胞分化和發(fā)育等。lncRNA可以從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳學等多個水平上調(diào)控基因表達[8-9]，其異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此以lncRNA 為基礎(chǔ)的診斷、治療將提供分子診療的新方法。國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 在許多腫瘤中異常表達，如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等[10-11]，并發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能。目前已有許多l(xiāng)nc-RNA 應(yīng)用于癌癥的診斷和預后，如PCA3、HOTAIR、MALAT1 等[12-13]，其中PCA3 是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準作為前列腺癌患者尿液中生物標志物的lncRNA[14]，對lncRNA 的研究有利于進一步了解神經(jīng)母細胞瘤的臨床診斷、風險評估及治療思路大有裨益。然而，目前l(fā)ncRNA 如何調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制仍存在巨大空白。因此，在神經(jīng)母細胞瘤中研究非編碼RNA 的異常表達和功能，是目前臨床診斷及治療領(lǐng)域迫切需要的。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2009年12月至2019年12月天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院收治的104 例神經(jīng)母細胞瘤患兒臨床樣本，均經(jīng)病理診斷為神經(jīng)母細胞瘤。取得手術(shù)標本后立即在液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。本研究獲得天津市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-AS、SK-N-Be2、SH-SY5Y 細胞均來自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），SK-N-SH 和IMR-32 來自中國科學院細胞庫。SH-SY5Y 和SK-N-SH 細胞使用含10%胎牛血清（美國Gibco 公司）以及1%雙抗（以色列BI 公司）的DMEM 培養(yǎng)基，IMR-32 細胞使用含10%胎牛血清以及1%雙抗的MEM 培養(yǎng)基；SK-N-AS 細胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，并添加1%青鏈雙抗以及1%非必須氨基酸（美國Gibco 公司）；SKN-Be2 細胞使用含10% 胎牛血清以及1% 雙抗的DMEM/F-12 培養(yǎng)基。細胞均于37℃，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的SK-N-AS 和SK-N-Be2 細胞消化后鋪于6 孔板中，置于37℃，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱待細胞長至80% 左右。按照說明書使用Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司）將LINC-00682 的siRNA 和陰性對照siNC 轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染6 h 后換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。siNC 和siLINC00-682 均購買自蘇州吉瑪公司。

1.2.2 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄 使用Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司）按照說明書提取細胞中的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT Master Mix（日本Takara 公司）將純度符合要求的RNA 按照說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總體系為20 μL。反應(yīng)條件為37℃30 min；85℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 實時熒光定量PCR 按照TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒（日本Takara 公司）說明書配制總反應(yīng)體系20 μL：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板3 μL，上、下游引物（10 μM）各0.6 μL，RNase free ddH2O為5.4 μL。樣品在Applied Biosystems 7 500實時熒光定量PCR 儀中使用兩步法進行擴增檢測，反應(yīng)條件為95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40 個循環(huán)。采用GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。GAPDH 上游引物序列：5’-TGCACCACC AACTGCTTAGC-3’，下游引物序列：5’-GGCATGGAC TGTGGTCATGAG-3’。LINC00682 上游引物序列：5’-TAGGGCGGGCTTGTGATAC-3’，下游引物序列：5’-TGAGGGTCGTGGATTCGGA-3’。MYCN 上游引物序列：5’-CGCAAAAGCCACCTCTCATTA-3’，下游引物序列：5’-TCCAGCAGATGCCACATAAGG-3’。

1.2.4 Western blot 實驗 使用含有蛋白酶抑制劑（瑞士Roche 公司）的RIPA 裂解液（北京索萊寶公司）裂解細胞提取蛋白質(zhì)，采用BCA 試劑盒（美國Thermo 公司）測定蛋白濃度。蛋白樣品用10% SDSPAGE 凝膠分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，在4℃冰箱搖床上孵育一抗過夜。然后用對應(yīng)的二抗在室溫條件下孵育1 h，最后使用ECL 熒光檢測試劑（美國Thermo 公司）進行曝光成像。

1.2.5 劃痕實驗 6 孔板背面每孔用記號筆畫間隔相等的橫線，將轉(zhuǎn)染的SK-N-AS 和SK-N-Be2 細胞接種于6 孔板，待細胞長至80%~90%后饑餓12 h 進行劃痕實驗。使用10 μL 吸頭于孔板中間垂直劃痕，PBS 清洗3 遍后用含2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。0 h 和24 h在顯微鏡下拍照，中間每隔3 h 計數(shù)細胞遷移距離，最后計算每孔細胞遷移的距離。

1.2.6 侵襲實驗 以1∶3 比例稀釋基質(zhì)膠（美國BD 公司）后取50 μL 均勻的鋪于Transwell 小室（美國CORNING 公司）中，放在37℃孵箱中1 h，待其凝固后加入200 μL 溫DMEM 培養(yǎng)液室溫重構(gòu)15 min后棄液。同時重懸細胞用無血清培養(yǎng)液將濃度調(diào)整至50×104/mL，然后取200 μL 細胞懸液加入至上室中。下室中加入600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。24 h后取出上室，用10%多聚甲醛（北京索萊寶公司）固定后染色。PBS 清洗擦拭干凈后在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 CCK-8 和生長曲線實驗 將轉(zhuǎn)染后的SK-N-AS和SK-N-Be2 細胞重懸，調(diào)整細胞濃度為3×104/mL，每孔100 μL 細胞懸液加入至96 孔板中。分別在24、48、72 h 加入CCK-8 試劑（北京索萊寶公司），37℃培養(yǎng)箱放置3 h 后使用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度。

將細胞消化重懸，以10×104/mL 的密度接種于6孔板。每隔1 天將細胞重懸計數(shù)，然后再以10×104/mL 的密度接種回6 孔板中，計數(shù)到第11 天為止。最后計算細胞的增殖速率。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。對分類變量進行χ2檢驗。對于組間比較，根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，采用Student’st檢驗、方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00682 在神經(jīng)母細胞瘤臨床標本和細胞系的表達

應(yīng)用實時定量PCR 技術(shù)檢測104 例神經(jīng)母細胞瘤臨床標本中LINC00682 的表達水平，發(fā)現(xiàn)LINC-00682 在高危組的表達顯著高于低危組（P＜0.000 1）和中危組（P＜0.05），見圖1A。分析標本的臨床病理特征與LINC00682 表達量的關(guān)系結(jié)果提示，LINC-00682 表達與神經(jīng)母細胞瘤患兒的腫瘤轉(zhuǎn)移、病理類型，臨床分期和預后顯著相關(guān)，與其他病理特征無顯著相關(guān)性（表1）。LINC00682 在神經(jīng)母細胞瘤MYCN擴增細胞系SK-N-Be2 和IMR-32 中的表達顯著高于非MYCN 擴增細胞系SK-N-SH、SK-N-AS 和SHSY5Y（圖1B）。同時從104 例臨床標本隨機選取48例標本應(yīng)用實時定量PCR 技術(shù)檢測MYCN 的表達量，并且分析LINC00682 和MYCN 表達水平的相關(guān)性，結(jié)果表明MYCN 的表達量和LINC00682 呈正相關(guān)，具有顯著性差異（P＜0.05，圖1C）。

表1 104 例神經(jīng)母細胞瘤患兒臨床病理分析

圖1 LINC00682 在神經(jīng)母細胞瘤臨床標本和細胞系的表達

2.2 低表達LINC00682 抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力

在神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-Be2 和SK-N-AS中，應(yīng)用小干擾RNA 抑制LINC00682 的表達（圖2A）。通過CCK8 實驗和生長曲線實驗檢測低表達LINC00682 后SK-N-Be2 和SK-N-AS 細胞增殖能力的變化，結(jié)果表明抑制LINC00682 表達后神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖能力顯著降低（圖2B，2C）。同時，通過侵襲實驗和劃痕實驗檢測低表達LINC00682 后SKN-Be2 和SK-N-AS 細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化，結(jié)果表明抑制LINC00682 表達后神經(jīng)母細胞瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯被抑制（圖3）。

圖2 低表達LINC00682 抑制神經(jīng)母細胞瘤的增殖能力

圖3 低表達LINC00682 抑制神經(jīng)母細胞瘤的轉(zhuǎn)移能力

2.3 低表達 LINC00682 抑制MYCN 的表達

在神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-Be2 應(yīng)用小干擾RNA 抑制LINC00682 的表達后，通過實時定量PCR和Western blot 實驗檢測MYCN mRNA 和蛋白的表達量，結(jié)果顯示低表達LINC00682 后MYCN 的mRNA 和蛋白表達水平也同樣受到抑制（圖4）。

圖4 低表達LINC00682 抑制MYCN mRNA 和蛋白水平的表達

3 討論

近年來，lncRNA 在神經(jīng)母細胞瘤中所發(fā)揮的作用逐漸被闡明[15]。Pandey 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NBAT1 的異常表達可以被用作神經(jīng)母細胞瘤診斷的生物標志物，NBAT1 可以抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖和侵襲，同時可以通過抑制NRSF/REST 增強神經(jīng)母細胞瘤分化。Barnhill 等[17]研究表明，lncRNA CAI2 通過促進p16 的異常表達進而使神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖能力增強，同時在晚期神經(jīng)母細胞瘤中l(wèi)ncRNA CAI2 表達顯著增高，有可能可以作為神經(jīng)母細胞瘤預后的生物標志物。LINC00682 在生物學功能和腫瘤領(lǐng)域的研究較少。一項原發(fā)性和復發(fā)性肝細胞癌中的全基因組甲基化研究表明，低水平的LINC00682 甲基化與HCC復發(fā)和患者疾病/無復發(fā)生存率密切相關(guān)[18]。在胃癌中LINC00682 可以作為miR-9 的ceRNA，促進LMX-1A 的表達，從而抑制腫瘤的進展[19]。本研究通過大量的臨床標本篩選和驗證發(fā)現(xiàn)，LINC00682 在高危組神經(jīng)母細胞瘤臨床標本中特異性高表達，表達水平與臨床病理指標中的腫瘤轉(zhuǎn)移、病理類型、臨床分期和預后顯著相關(guān)。通過細胞實驗進一步發(fā)現(xiàn)降表達LINC-00682 后，神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制。

MYCN 是Myc 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在神經(jīng)母細胞瘤的腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，包括細胞生長、分化和侵襲性表型[20]。MYCN 異常擴增和N-Myc 癌蛋白的過度表達（發(fā)生在20%~25%的神經(jīng)母細胞瘤患者和40%的高危病例中）是神經(jīng)母細胞瘤最重要的危險因素和不良預后遺傳標記[21-22]。過去的幾十年中，許多基因已經(jīng)被證明可以增強或減弱N-Myc 的促癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00682 在MYCN 擴增的SKN-Be2 和IMR-32 細胞系中存在高表達，在SK-NBe2 細胞系中降表達LINC00682 后MYCN 的mRNA和蛋白水平同時受到抑制。

在腎癌中，miR-144-3p 能與MYCN mRNA 結(jié)合并抑制其表達，而LncRNA NORAD 能通過與miR-144-3p 結(jié)合來促進MYCN 的表達[23]。在橫紋肌肉瘤和神經(jīng)母細胞瘤中，MYCNOS-01 的高表達會降低MYCN 的蛋白水平，而MYCN 表達的降低也會增加MYCNOS-01 的表達，MYCNOS-01 和MYCN 之間形成了一個負反饋調(diào)節(jié)[24]。在神經(jīng)母細胞瘤中，Lnc USMycN 通過與RNA 結(jié)合蛋白NonO 結(jié)合后調(diào)節(jié)MYCN 的表達[25]。LncRNA 調(diào)控MYCN的機制研究日漸深入，本研究組后期將針對上述方向深入研究LINC00682 調(diào)控MYCN 表達的機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LINC00682 可以作為一個新的臨床生物學指標預判神經(jīng)母細胞瘤患兒的臨床預后。同時，推斷LINC00682 可以調(diào)節(jié)神經(jīng)母細胞瘤中重要的致癌基因MYCN 的表達，其有可能成為治療神經(jīng)母細胞瘤的新靶點，但其具體機制尚需進一步研究。