季開心，陳思言，張敏杰，張苗苗

正畸牙齒移動(dòng)是外力作用下引發(fā)的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，可以使牙周組織發(fā)生損傷與重建[1]。加力后牙周微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)被打破，牙周組織的微循環(huán)受到干擾，壓力側(cè)局部組織缺血、血管壓縮，白細(xì)胞發(fā)生遷移[2]。當(dāng)組織適應(yīng)機(jī)械外力后，牙周微環(huán)境發(fā)生改變，細(xì)胞損傷程度加重，觸發(fā)細(xì)胞死亡，引起炎癥性改變，釋放炎癥介質(zhì)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)等，共同調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化[3]。RANKL與OPG的表達(dá)含量可以代表牙周組織改建的活躍程度[4-6]。

有研究發(fā)現(xiàn)牙齒移動(dòng)過(guò)程中表達(dá)壞死性凋亡的關(guān)鍵蛋白——受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein 1/3，RIP1/3)，提示壞死性凋亡參與了牙齒移動(dòng)過(guò)程。壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)可以降低壞死性凋亡的發(fā)生率[7-9]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中存在壞死性凋亡，但壞死性凋亡如何參與牙齒正畸過(guò)程中牙周組織的改建目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

正畸結(jié)扎絲(新亞，中國(guó))；6 mm鎳鈦拉簧(速航科技，中國(guó))；酸蝕劑(杭州生物，中國(guó))；粘結(jié)劑、樹脂(3M，美國(guó))；游標(biāo)卡尺(美耐特，中國(guó))；石蠟切片機(jī)(瑞沃生命科技，中國(guó))；全自動(dòng)脫水機(jī)(上海三葳醫(yī)療，中國(guó))；組織包埋機(jī)(泰維科技，中國(guó))；光學(xué)顯微鏡(徠卡，德國(guó))；水合氯醛(科密歐，中國(guó))；多聚甲醛(金穗化工，中國(guó))；EDTA(九州化工，中國(guó))；Nec-1(MCE，中國(guó))；兔抗鼠RANKL多克隆抗體、兔抗鼠OPG多克隆抗體(Affinity，中國(guó))；SABC免疫組化試劑盒(博士德，中國(guó))；DAB顯色試劑盒(卡諾斯，中國(guó))。

1.2 構(gòu)建牙齒移動(dòng)模型與實(shí)驗(yàn)分組

選擇6周齡雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量為(206.43±10.43)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。10%水合氯醛溶液進(jìn)行大鼠腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)后，將6 mm鎳鈦拉簧兩端用光固化流動(dòng)樹脂分別固定在上頜切牙以及左側(cè)第一磨牙處，保持拉簧力值為50 g，同時(shí)磨短下頜切牙，建立正畸牙齒移動(dòng)(orthodontic tooth movement，OTM)模型。按照是否加力以及注射Nec-1，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、抑制劑組(B組)、加力組(C組)、加力+抑制劑組(D組)。C、D兩組構(gòu)建OTM模型，A、C兩組分別在第1、3、7、10、14天上午8時(shí)腹腔注射生理鹽水，注射劑量為1 mg/(kg·d)，B、D兩組于同一時(shí)間腹腔注射Nec-1，注射計(jì)量為1 mg/(kg·d)。

1.3 組織取材

各組大鼠在注射藥物當(dāng)天下午5時(shí)進(jìn)行麻醉后依次灌注生理鹽水以及多聚甲醛溶液，取大鼠上頜左側(cè)頜骨組織，以待后續(xù)操作。

1.4 牙齒移動(dòng)距離測(cè)量

游標(biāo)卡尺測(cè)量左側(cè)第一磨牙近中邊緣嵴與第三磨牙遠(yuǎn)中邊緣嵴距離，移動(dòng)距離為兩次測(cè)量距離之差，由同一實(shí)驗(yàn)者測(cè)量3次，取3次平均值。

1.5 制備切片

多聚甲醛對(duì)大鼠上頜骨標(biāo)本體外固定，使用EDTA對(duì)標(biāo)本脫鈣后，石蠟脫水包埋。沿牙體長(zhǎng)軸矢狀向連續(xù)切片，每個(gè)切片厚度在4 μm左右，恒溫烤片2 h，對(duì)上頜左側(cè)第一磨牙壓力側(cè)牙周組織進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色，染色后顯微鏡觀察。

1.6 HE染色

將切片用蘇木精溶液進(jìn)行染色5 min，稀氨水(1%)浸泡30 s，伊紅溶液染色1 min，應(yīng)用中性樹脂封膠處理，顯微鏡下觀察。

1.7 免疫組化染色與平均光密度測(cè)量

切片用山羊血清封閉處理并與一抗RANKL抗體(濃度1∶300)和OPG抗體(濃度1∶250)共同孵育過(guò)夜后，再與二抗(濃度1∶200)繼續(xù)孵育4 h。孵育后用DAB檢測(cè)試劑盒顯色，利用Image-Pro-Plus9.0進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞分析，計(jì)算平均光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)對(duì)比應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠第一磨牙移動(dòng)距離

A、B組牙齒在各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)移動(dòng)。第3、7、10、14天時(shí)，C、D組第一磨牙均向近中明顯移動(dòng)，且C組牙齒移動(dòng)距離較D組明顯增加(P<0.05)，如表1所示。

表1 大鼠牙齒移動(dòng)距離

2.2 大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)玻璃樣變變化

切片HE染色后發(fā)現(xiàn)，A、B兩組大鼠第一磨牙在各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)明顯的玻璃樣變區(qū)域。C組第一磨牙在第1、3天時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的玻璃樣變區(qū)域；第7天可以觀察到壓力側(cè)出現(xiàn)大面積玻璃樣變區(qū)域，牙周膜間隙縮窄，膠原纖維發(fā)生斷裂；第10天時(shí)玻璃樣變區(qū)域變小，牙周膜間隙略增寬；第14天時(shí)玻璃樣變區(qū)域持續(xù)減小，牙齒移動(dòng)。D組加入Nec-1后，第一磨牙壓力側(cè)第1、3、7天時(shí)出現(xiàn)的玻璃樣變區(qū)域不明顯，牙周膜間隙縮窄，在第10天時(shí)壓力側(cè)出現(xiàn)明顯的玻璃樣變區(qū)域，第14天時(shí)玻璃樣變區(qū)域減少(圖1)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；紅色箭頭代表大面積玻璃樣變區(qū)域

2.3 大鼠第一磨牙壓力側(cè)RANKL、OPG變化

本實(shí)驗(yàn)中，A、B組在第1、3、7、10、14天RANKL、OPG表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。C組中RANKL、OPG表達(dá)隨著時(shí)間逐漸遞增，RANKL在第7天時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰，OPG在第10天時(shí)表達(dá)達(dá)到頂峰，之后隨著加力時(shí)間的增加，表達(dá)呈下降趨勢(shì)，各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于A組(P<0.05)。加入壞死性凋亡抑制劑Nec-1后，D組中RANKL、OPG表達(dá)趨勢(shì)與C組一致，較A、B組表達(dá)增強(qiáng)；第7、10天時(shí)，C、D兩組RANKL、OPG比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2～3，表2～3)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；紅色箭頭代表陽(yáng)性表達(dá)

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；紅色箭頭代表陽(yáng)性表達(dá)

表2 不同加力時(shí)間大鼠第一磨牙壓力側(cè)RANKL平均光密度值變化

表3 不同加力時(shí)間大鼠第一磨牙壓力側(cè)OPG平均光密度值變化

3 討 論

壞死性凋亡是一種與炎癥相關(guān)、受細(xì)胞調(diào)節(jié)的死亡過(guò)程[10-11]。當(dāng)細(xì)胞中caspase缺失或被抑制，受體相互作用蛋白激酶RIP1和RIP3在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)誘導(dǎo)下，募集MLKL形成壞死小體，發(fā)生壞死性凋亡。Nec-1是一種小分子生物堿，可以有效抑制壞死性凋亡，避免細(xì)胞發(fā)生壞死[12]。單獨(dú)應(yīng)用Nec-1對(duì)健康細(xì)胞中的ATP水平、線粒體膜電位、質(zhì)膜完整性、細(xì)胞形狀、細(xì)胞分化以及增殖等均無(wú)影響[13-14]。本實(shí)驗(yàn)僅使用Nec-1后，RANKL與OPG的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，提示Nec-1不直接影響RANKL與OPG的表達(dá)。而在加力時(shí)使用Nec-1，牙齒移動(dòng)距離縮短，證明壞死性凋亡參與了牙齒移動(dòng)過(guò)程。

壞死性凋亡在細(xì)胞死亡中發(fā)揮促炎作用[15]。與其他類型的細(xì)胞死亡方式相比，壞死性凋亡的獨(dú)特性在于其會(huì)觸發(fā)危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMPs)進(jìn)而引發(fā)炎癥。當(dāng)牙周組織發(fā)生大量炎癥反應(yīng)時(shí)，其本身不能發(fā)生適應(yīng)性改建后則出現(xiàn)玻璃樣變區(qū)域，阻礙牙齒移動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)中，加入抑制劑Nec-1可以使加力后壓力側(cè)出現(xiàn)大范圍的玻璃樣變區(qū)域變晚，提示抑制壞死性凋亡會(huì)延遲玻璃樣變出現(xiàn)的時(shí)間，但壞死性凋亡與玻璃樣變之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

破骨細(xì)胞的形成以及骨改建激活取決于牙周組織中細(xì)胞因子的表達(dá)含量[16-17]。破骨細(xì)胞分化成熟后可吸收壓力側(cè)牙槽骨，促使牙齒移動(dòng)。在壓力側(cè)微環(huán)境中，RANKL、OPG以及RANK都發(fā)揮著重要的作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)OPG在破骨細(xì)胞形成過(guò)程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，可抑制破骨細(xì)胞形成，減緩牙齒移動(dòng)[18]。Aoki等[19]、Noguchi等[20]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，增加RANKL含量會(huì)上調(diào)破骨細(xì)胞前體中的RANK表達(dá)，加快破骨細(xì)胞形成，提高牙齒移動(dòng)速度。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠單獨(dú)進(jìn)行加力后，RANKL與OPG的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與破骨細(xì)胞形成規(guī)律相一致，提示在正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中引發(fā)的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，可以使RANKL與OPG的表達(dá)增高，參與破骨細(xì)胞形成。加力時(shí)使用Nec-1可減少RANKL與OPG的表達(dá)，提示抑制牙周組織中壞死性凋亡的發(fā)生，可以減輕牙周組織中的炎癥反應(yīng)，影響破骨細(xì)胞的形成與分化。以上結(jié)果提示，在牙齒移動(dòng)過(guò)程中，正畸力可能會(huì)激發(fā)壓力側(cè)牙周組織產(chǎn)生壞死性凋亡，發(fā)生壞死性凋亡后，壓力側(cè)牙周組織環(huán)境發(fā)生改變，炎癥反應(yīng)程度逐漸加重，刺激成骨細(xì)胞分泌RANKL等細(xì)胞因子，幫助破骨細(xì)胞形成與分化，促使牙齒移動(dòng)。當(dāng)使用Nec-1后，壞死性凋亡被抑制，壓力側(cè)牙周組織炎癥反應(yīng)減輕，破骨細(xì)胞形成與分化不活躍，牙槽骨改建速度下降，造成牙齒移動(dòng)速率變緩。

綜上所述，壞死性凋亡可以促進(jìn)牙齒移動(dòng)，還可能導(dǎo)致了玻璃樣變的發(fā)生，但壞死性凋亡與牙齒移動(dòng)之間的關(guān)系還需更多實(shí)驗(yàn)的支持。本實(shí)驗(yàn)以期能為牙齒移動(dòng)機(jī)制提供新思路，為更加深入了解壞死性凋亡與牙齒移動(dòng)的關(guān)系提供新視角。