盧曉琳，王 歡，曹 猛，金作林

牙槽骨改建是維持顱頜面骨骼正常形態(tài)結構的重要環(huán)節(jié)，也是正畸牙齒移動的生物學基礎。牙槽骨在正畸力的作用下處于骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡過程，壓力側破骨細胞分化成熟，促進骨吸收；張力側成骨細胞增殖分化，增強新骨形成[1]。但是關于牙槽骨代謝的具體作用機制目前尚不明確。ClC型氯通道是一種電壓門控型氯通道。其中，ClC-3作為電壓門控型氯通道之一，存在于細胞膜或細胞器膜上，參與調節(jié)細胞容積、細胞遷移、增殖與凋亡以及細胞器酸化等多種生物活動[2-3]。而且，ClC-3氯通道在骨代謝方面也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，其基因敲除小鼠自出生后就表現出發(fā)育遲緩、鈣磷代謝異常等骨骼畸形，伴隨較高的死亡率[4-6]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)調控相應靶基因表達的前提是通過TGF-β1受體(TGF-β1 receptor，TβR)介導的，即處于活化狀態(tài)的TGF-β1分子與細胞膜上的TβR相結合。TβR主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種，其中Ⅰ型和Ⅱ型受體位于細胞膜上，直接參與信號的轉導[7-8]。研究發(fā)現，在ClC-3氯通道調控成骨分化過程中，TGF-β1信號分子的表達與ClC-3氯通道有十分密切的聯(lián)系[9]。

ClC-3氯通道和TβR在促進成骨分化中是否具有某種內在的聯(lián)系，目前還不明確。本研究旨在初步探索TβR對ClC-3氯通道在成骨細胞中的促成骨分化作用，擬通過觀察成骨細胞中不同表達水平的ClC-3氯通道和TβR表達的相互影響，為ClC-3氯通道在促成骨分化機制方面研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

α改良伊格爾基本成分(α-MEM)培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素(Hyclone公司，美國)；MC3T3-E1細胞系(此細胞株是小鼠成骨前體細胞，可以分化為成熟的成骨細胞。由西安飛揚生物科技有限公司提供)；TGF-β1受體抑制劑(LY2109761，Selleck公司，美國)；CCK-8試劑(Sigma公司，美國)；Trizol(Invitrogen公司，美國)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)；Real-Time PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)；脂質體2000(LipofectamineTM2000，Invitrogen公司，美國)；ClC-3抗體(CST，美國)；二抗(CST，美國)。

1.2 TβR抑制劑(LY2109761)的配制

將5 mg TβR抑制劑(LY2109761)溶解于1.132 45 mL的二甲基亞砜(DMSO)溶液中，得到濃度為10 mmol/L的儲存液，以每管20 μL分裝于EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。工作液是將儲存液按濃度梯度稀釋到所需?0、2、0.2 μmol/L的濃度。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組

將細胞系MC3T3-E1以1×104個/mL的密度接種于六孔板中，選取細胞生長狀況良好，融合面積為80%左右的細胞給予LY2109761的刺激。分為三大組，A：空白對照組；B：0.2、2、20 μmol/L作用24 h組；C：0.2、2、20 μmol/L作用48 h組。

1.4 LY2109761細胞毒性檢測(CCK-8比色法)

以每孔約100 μL的細胞懸液(2×104個/mL)接種到96孔板中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁。向培養(yǎng)板中加入10 μL三種濃度的抑制劑(LY2109761)分別培養(yǎng)24和48 h。向每孔中分別加入10 μL的CCK-8溶液后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，測定各組細胞在450 nm處的吸光度值，以上實驗步驟重復至少三次。其中細胞死亡率=100%-細胞活力，細胞活力=(A(加藥)-A(空白))/(A(0加藥)-A(空白))×100%。A(加藥)為具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A(空白)為具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A(0加藥)為具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

1.5 RNA 提取和Real-time PCR

按照Trizol試劑盒說明提取細胞總RNA，將LY2109761不同濃度不同作用時間處理后的各組細胞提取總RNA：選取生長良好的細胞，棄去培養(yǎng)液，使用PBS輕輕沖洗兩遍；在每孔中加入Trizol，裂解，靜置。轉移上清液至新的EP管。在上清液中加入氯仿，至樣品分為透明上清、白色蛋白和有機物三層。吸出透明血清，加入異丙醇，棄去上清液。向沉淀物中加入75%的乙醇，棄去上清液。向沉淀中加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水，使用分光光度計將提取物定量。

按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，然后將其稀釋10倍，將稀釋后的cDNA進行Real-time PCR反應。特異性引物序列如下(表1)。

表1 PCR引物序列及引物大小

1.6 Western Blot檢測

將細胞置于冰上，加入蛋白裂解液，離心，提取細胞總蛋白，蛋白質定量試劑盒(BCA)法進行蛋白定量。將蛋白放至100 ℃加熱5 min使其變性，凝膠電泳，轉膜，孵育一抗4 ℃過夜，孵育二抗，化學發(fā)光試劑盒(ECL)發(fā)光，使用Image-J軟件對蛋白進行掃描及灰度值分析。

1.7 siRNA基因轉染

將MC3T3-E1細胞以2×104個/mL接種于六孔板中，待細胞密度融合至70%左右時進行siRNA的轉染。分別使用Opti-MEM稀釋ClC-3 siRNA和Lipo2000轉染試劑，使轉染細胞的最終濃度為50 nmol/L，二者輕輕混合，室溫下靜置20 min。將轉染復合物加入到細胞中，孵育6 h，更換常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.8 統(tǒng)計學方法

以上實驗結果應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數據進行統(tǒng)計分析，實驗數據均以“均數±標準差”表示，采用單因素方差分析各實驗組。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同作用方式的TβR抑制劑細胞毒性的結果

與空白對照組相比，0.2、2、20 μmol/L濃度的TβR抑制劑分別作用24 h和48 h對MC3T3-E1細胞都具有細胞毒性(P<0.05)。相同作用時間時，抑制劑的細胞毒性隨作用濃度的增大而增大，不同作用濃度的抑制劑之間對細胞毒性作用均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其中0.2、2 μmol/L濃度的抑制劑作用24 h時的細胞毒性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TβR抑制劑在相同作用濃度時，作用時間越短，細胞毒性越小(P<0.05)，以濃度為0.2 μmol/L的TβR抑制劑作用24 h對細胞的毒性作用最小(圖1)。

A：不同作用濃度的TβR抑制劑在相同作用時間對細胞毒性的影響;B：相同作用濃度的TβR抑制劑在不同作用時間對細胞毒性的影響;*：P<0.05，**：P<0.01

2.2 TβR抑制劑對TβRⅠ、TβRⅡ基因表達的影響

Real-Time PCR結果顯示，0.2、2 μmol/L濃度的TβR抑制劑作用MC3T3-E1細胞24 h后，都可以抑制TβRⅠ、TβRⅡ基因的表達(P<0.05)。而對TβRⅠ、TβRⅡ基因表達的抑制效果隨濃度增大而增強(P<0.05)(圖2)。

*：P<0.05，**：P<0.01

2.3 TβRⅠ、TβRⅡ對ClC-3氯通道表達的影響

濃度為2 μmol/L的TβR抑制劑對MC3T3-E1細胞作用24 h后的Real-Time PCR和Western結果表明，與空白對照組相比，TβR抑制劑組促進ClC-3氯通道基因和蛋白的表達(圖3)。

A：阻斷TβRⅠ、TβRⅡ的表達對ClC-3基因的影響；B：阻斷TβRⅠ、TβRⅡ的表達對ClC-3蛋白的影響；C：ClC-3蛋白灰度分析；*：P<0.05

2.4 ClC-3氯通道對TβRⅠ、TβRⅡ表達的影響

對MC3T3-E1細胞進行ClC-3 siRNA基因轉染，ClC-3 siRNA轉染序列如下，Sense：5′-CGA GAG AAG UGU AAG GAC ATT-3′；Anti-sense：5′-UGU CCU UAC ACU UCU CUC GTT-3′。轉染序列的有效性在前期實驗已得到驗證。Real-Time PCR結果顯示，阻斷ClC-3氯通道的表達，可以促進TβRⅠ和TβRⅡ基因的表達(P<0.05)(圖4)。

*：P<0.05，**：P<0.01

2.5 TβR對成骨分化相關基因(Alp、Runx2)表達的影響

分別使用ClC-3 siRNA和TβR抑制劑阻斷氯通道和TβR的表達，觀察Alp、Runx2的變化。Real-Time PCR結果顯示，TβR抑制劑組的Alp和Runx2的表達均升高(P<0.05)，而ClC-3抑制劑組的Alp和Runx2基因表達下降(P<0.05)(圖5)。

與空白對照相比，*：P<0.05，**：P<0.01

3 討 論

正畸牙齒的移動是通過壓力側牙槽骨吸收，張力側牙槽骨新骨形成穩(wěn)定在新的位置。ClC-3氯通道作為電壓門控型氯通道之一，存在于細胞膜或細胞器膜上，在正畸骨改建過程中，ClC-3氯通道被證實參與骨代謝的生物信號傳導過程[10]。ClC-3氯通道在小鼠的骨髓間充質干細胞、成骨細胞以及成骨前體細胞系中均可表達， 能夠促進成骨細胞的成骨分化[11]。TGF-β1生長因子在骨架形態(tài)發(fā)生和成骨細胞分化過程中具有重要作用[12-14]。研究表明，TGF-β1與ClC-3氯通道的表達有緊密聯(lián)系[9]。阻斷TGF-β1表達可促進ClC-3氯通道對骨代謝的調控。TGF-β1通常是以異構受體復合體發(fā)揮作用，與TβRⅠ、TβRⅡ在細胞表面結合后引發(fā)后續(xù)的細胞應答[15]。但是關于TβR在ClC-3氯通道調控成骨分化過程中的作用目前還未見相關研究。

TβR抑制劑按作用方式分為選擇性單獨抑制TβRⅠ或TβRⅡ以及同時抑制TβRⅠ和TβRⅡ表達等幾種類型[16]。本研究通過選用同時抑制TβRⅠ和TβRⅡ表達的小分子受體激酶抑制劑(LY2109761)來阻斷TGF-β1下游受體，觀察對ClC-3氯通道在成骨分化過程中的作用。首先，本實驗將TβR抑制劑對TβRⅠ和TβRⅡ基因的最佳作用方式進行篩選，根據細胞的不同，許多文獻研究使用了0.2～10.0 μmol/L的濃度范圍的同種抑制劑作用不同時間來研究細胞功能[17-18]，但是還沒有對TβR抑制劑作用于MC3T3-E1細胞進行過多的研究。經過預試驗的篩選，最終選取了0.2、2、20 μmol/L三種濃度梯度分別作用24 h和48 h來觀察TβRⅠ和TβRⅡ抑制劑對MC3T3-E1的細胞毒性。細胞毒性試驗結果表明隨著抑制劑濃度增大、作用時間延長其細胞死亡率也在升高，這說明抑制劑對細胞的毒副作用隨著劑量和作用時間而增大，并且抑制劑在0.2 μmol/L和2 μmol/L的濃度作用24 h時細胞的死亡率并無統(tǒng)計學意義，這可能說明TβR抑制劑在對MC3T3-E1細胞作用時間較低時，作用濃度在較小的范圍之間發(fā)生波動對細胞的毒性沒有太大影響，而超出一定濃度，則會提高細胞的死亡率。而將0.2 μmol/L和2 μmol/L兩種濃度梯度的抑制劑作用24 h來觀察TβRⅠ和TβRⅡ兩種受體基因的表達結果顯示，2 μmol/L的TβR抑制劑對TβR I、TβRⅡ基因表達的抑制效果強于0.2 μmol/L濃度。濃度為2 μmol/L的TβR抑制劑作用于MC3T3-E1細胞24 h對TβRⅠ和TβRⅡ基因的抑制效果已經達到65%左右，并且產生的細胞毒性在可接受的范圍內，不會對細胞的生長和增殖產生過度的抑制。

綜上，本研究選取濃度為2 μmol/L的TβR抑制劑作用MC3T3-E1細胞24 h作為最佳作用方式抑制TβR的表達，并進一步觀察其對ClC-3氯通道的影響。結果顯示，當抑制TβR表達時，ClC-3氯通道的基因和蛋白水平表達升高。另一方面，當阻斷ClC-3氯通道表達時，同樣也會促進TβR的表達。這說明TβR和ClC-3氯通道的表達是相互抑制的。由此猜想，這可能和TβRⅠ、TβRⅡ以及ClC-3氯通道的細胞內定位有關。TβRⅠ、TβRⅡ位于細胞膜上，ClC-3氯通道細胞膜和細胞器膜上也有表達，基于此推測，TβR和ClC-3在細胞膜上的表達存在競爭性關系，當其中一個的表達被抑制時，可促進對方的表達，因此，ClC-3氯通道與TβR的表達可能表現為相互影響的關系。我們在干擾ClC-3氯通道表達時，TβRⅡ的表達與空白對照組相比升高了80%，而TβRⅠ表達升高了50%，這說明，TβRⅡ對不同表達水平的ClC-3氯通道更敏感，這可能和TβRⅡ本身的生物學特性有關，TβRⅡ通常首先通過自身的激活，才能使TGF-β1配體和胞膜上活化的Ⅱ型受體結合，形成異源二聚體，然后再結合Ⅰ型受體形成異三聚體復合物。本研究發(fā)現抑制TβR的表達，可促進成骨相關基因(Alp、Runx2)的表達，而ClC-3抑制劑組的成骨相關基因表達與對照組相比卻下降，其中TβR抑制劑組的Alp基因升高程度較Runx2基因明顯。Alp是成骨分化過程中的早期標志物，在骨形成早期活性較高[19]，Runx2是成骨細胞分化過程中關鍵的轉錄調控因子，發(fā)揮中心調控的作用[20-21]。由此推測TβR在早期對ClC-3氯通道調控成骨分化的影響更顯著。綜上所述，在正畸骨改建過程中，TβR可抑制ClC-3氯通道對成骨細胞分化的調控，但是其具體的分子機制還有待進一步深入的研究。