李桂馨， 劉 慧， 姜倩倩， 陳紅松， 魯鳳民

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的主要致病因素。目前，全球慢性HBV感染者高達(dá)2.96億。若不及時(shí)進(jìn)行有效的抗病毒治療，有15%～40%的CHB患者可進(jìn)展至肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病[1-2]。目前，臨床用于治療慢性HBV感染的藥物包括核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues，NAs]與長效干擾素，這兩種藥物均可顯著減緩疾病進(jìn)展，有效減少終末期肝病的發(fā)生。其中，NAs強(qiáng)效抑制HBV復(fù)制，可快速降低患者體內(nèi)HBV DNA水平，且口服方便，在臨床上被廣泛使用。但由于停藥后易出現(xiàn)病毒反彈及疾病復(fù)發(fā)，接受NAs治療的患者往往需要長期甚至終生服藥；而長效干擾素類藥物，盡管抑制病毒復(fù)制的能力相對(duì)較弱，但在一些病毒載量特別是血清表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)較低的優(yōu)勢人群，可顯著提高臨床治愈[3]。但由于存在引發(fā)患者出現(xiàn)不同程度副作用的風(fēng)險(xiǎn)，臨床上對(duì)長效干擾素的使用往往采取有限療程的策略。更為重要的是，二者均無法清除或持續(xù)靜默HBV轉(zhuǎn)錄模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)[4]。因此，針對(duì)HBV復(fù)制不同環(huán)節(jié)的抗病毒新藥的研發(fā)顯得尤為重要。

1 HBV生命周期概述

在HBV Dane顆粒感染肝細(xì)胞的過程中，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的核衣殼脫去包膜并被轉(zhuǎn)運(yùn)到核孔復(fù)合體附近，核衣殼因主動(dòng)或被動(dòng)變構(gòu)被打開，所含的基因組松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)隨即被遞送進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)，經(jīng)宿主DNA修復(fù)系統(tǒng)形成cccDNA，建立感染。作為復(fù)制模板的cccDNA可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生包括前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在內(nèi)的病毒RNA，其中pgRNA作為典型的雙順反子結(jié)構(gòu)，是翻譯產(chǎn)生核心蛋白(HBV core，HBc)和病毒聚合酶(polymerase，P)蛋白的信使RNA(mRNA)。翻譯產(chǎn)生的P蛋白隨即與其轉(zhuǎn)錄模板pgRNA結(jié)合形成復(fù)合物[5]，并招募二聚體化的核心蛋白通過相鄰二聚體界面疏水相互作用最終組裝成正二十面體的核衣殼。在核衣殼內(nèi)部，pgRNA被P蛋白逆轉(zhuǎn)錄為rcDNA，含rcDNA的核衣殼即成為成熟的核衣殼，后者或獲得包膜形成Dane顆粒釋放至細(xì)胞外，開始下一個(gè)循環(huán)，或重新被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)以回補(bǔ)cccDNA池[6](見圖1)。由此可見，無論是在從頭感染過程中，還是新合成的攜帶rcDNA的核衣殼，其在特定的空間位置被有序地打開以釋放rcDNA入核，或精細(xì)地組裝成包裹P蛋白/pgRNA復(fù)合物的核衣殼，對(duì)于有效建立感染和病毒的持續(xù)復(fù)制都是至關(guān)重要的。

圖1 乙型肝炎病毒生命周期示意圖[7]

2 核衣殼抑制劑作用機(jī)制

如前所述，核衣殼在病毒基因組包裝、提供逆轉(zhuǎn)錄場所、胞內(nèi)運(yùn)輸及維持cccDNA池穩(wěn)定等病毒生命周期的多個(gè)環(huán)節(jié)均有重要作用[8]。鑒于核衣殼在HBV復(fù)制中的多重作用，研發(fā)人員已將其作為重要的直接抗病毒靶點(diǎn)，并相應(yīng)研發(fā)出一類代表性藥物核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(core protein allosteric modulators，CpAMs)。CpAMs可干擾正常核衣殼形成從而抑制pgRNA包裝及隨后的HBV DNA復(fù)制；也可作用于已包裝的成熟核衣殼，誘導(dǎo)其變構(gòu)或錯(cuò)誤解聚，導(dǎo)致rcDNA無法被精準(zhǔn)遞送至細(xì)胞核，最終抑制cccDNA合成[9-10]。另外，少量文獻(xiàn)也已發(fā)現(xiàn)CpAMs還具有直接降低HBV e抗原(HBV e antigen,HBeAg)的作用[11-12]。目前，已有多種不同結(jié)構(gòu)類型的CpAMs處于臨床研發(fā)階段(見表1)。

表1 CpAMs臨床試驗(yàn)總結(jié)

表1中的ABI-H0731由Assembly Biosciences公司開發(fā)[13]，其展示的作用機(jī)制主要包括：(1)干擾核衣殼有效包裹pgRNA/P蛋白復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致rcDNA無法被合成，最終抑制Dane顆粒合成及釋放。但須注意的是，該作用同樣也顯著抑制了HBV RNA病毒樣顆粒的釋放。(2)抑制從頭感染后肝細(xì)胞內(nèi)脫去包膜的成熟核衣殼的正確解聚，干擾rcDNA的遞送入核及后續(xù)cccDNA形成，直接導(dǎo)致感染無法建立。(3)對(duì)于已建立感染的肝細(xì)胞，其對(duì)子代新合成rcDNA的抑制將使cccDNA貯存池的補(bǔ)充難以為繼，長期用藥可能使cccDNA耗竭(見圖2)。CpAMs的這些作用使其成為備受關(guān)注的在研直接抗乙肝病毒藥物，并被人們寄予極大的希望。

圖2 核衣殼抑制劑ABI-H0731作用機(jī)制圖[引自EASL 2021(PO-482)][13]

3 NAs治療下HBV RNA可反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性并作為安全停藥評(píng)價(jià)指標(biāo)

2017年，Lok等[14]歐美專家在共識(shí)中提出了“部分治愈”(partial cure)的概念。這一概念隨后于英國倫敦召開的“2019歐洲肝病研究協(xié)會(huì)-美國肝病研究協(xié)會(huì)HBV治療終點(diǎn)會(huì)議”上被再次強(qiáng)調(diào)。所謂部分治愈，是指接受NAs治療的患者雖仍能檢測到HBsAg，但其HBV DNA水平低于靈敏試劑檢測下限并在停藥后仍能維持HBV DNA不反彈、ALT水平正常。但由于需要停藥觀察才能知道哪部分CHB患者達(dá)到了“部分治愈”。為減少停藥后疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，各大主流指南均推薦在患者血清HBV DNA低于檢測下限12～36個(gè)月甚至更長時(shí)間的鞏固治療后才停藥，以提高停藥的安全性[15-17]。然而，即便嚴(yán)格遵循指南的指導(dǎo)意見，仍有相當(dāng)比例的患者在停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)反彈，甚至發(fā)生暴發(fā)性肝炎。其原因在于NAs作用于核衣殼內(nèi)以pgRNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄過程，通過與細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核苷酸競爭性摻入并不可逆地阻斷rcDNA負(fù)鏈合成[18]，從而使得患者的血清HBV DNA很快低于檢測下限。但此時(shí)cccDNA仍可有活躍轉(zhuǎn)錄，因此，臨床上以血清HBV DNA“消失”作為NAs安全停藥的指標(biāo)并不恰當(dāng)。近年來一些研究也已證實(shí)，HBV復(fù)制過程中，部分被核衣殼包裹但未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的HBV pgRNA也可獲得包膜，進(jìn)而形成RNA病毒樣顆粒并被釋放至血清中[19-20]。并且，當(dāng)NAs阻斷以pgRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成rcDNA時(shí)，核衣殼包裹的處于NAs作用下的殘余HBV pgRNA將以HBV RNA病毒樣顆粒的形式釋放入血循環(huán)[19]。因此，升高的血清HBV RNA水平可反映宿主肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)。對(duì)比而言，此時(shí)患者血清HBV DNA的“消失”僅僅代表NAs阻斷HBV DNA復(fù)制的有效性，并不代表cccDNA的耗竭或轉(zhuǎn)錄靜默，而決定停藥后病毒學(xué)反彈和臨床復(fù)發(fā)的原因是感染肝細(xì)胞核內(nèi)有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA的存在。因此，在后續(xù)的研究中以HBV DNA和RNA雙檢測陰性作為鞏固治療后NAs停藥的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[21]，使得NAs的安全停藥得到了保證。血清HBV RNA作為反映cccDNA活躍轉(zhuǎn)錄的血清學(xué)指標(biāo)也被寫入歐美國家及我國的新版指南中[15-17]。

4 核衣殼抑制劑臨床試驗(yàn)結(jié)果解讀及藥物評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇的重要性

截至目前，ABI-H0731是臨床試驗(yàn)進(jìn)展最快的核衣殼抑制劑之一，已經(jīng)完成臨床 Ⅱ 期研究，其公布的201研究共招募了47例HBeAg(+)及26例HBeAg(-)的NAs經(jīng)治CHB患者，分別進(jìn)行NAs聯(lián)合ABI-H0731或NAs聯(lián)合安慰劑治療。該項(xiàng)研究結(jié)果顯示，相較于聯(lián)合安慰劑治療，NAs聯(lián)合ABI-H0731治療24周后，更多的經(jīng)治患者達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答[HBeAg(-)：94% vs 70%；HBeAg(+)：83% vs 29%]。其公布的202研究招募了25例HBeAg(+)的初治CHB患者，研究結(jié)果顯示，相較于聯(lián)合安慰劑治療，恩替卡韋(entecavir，ETV)聯(lián)合ABI-H0731治療24周后患者的HBV DNA、HBV pgRNA水平明顯降低、ALT復(fù)常率明顯升高。這些結(jié)果說明聯(lián)合ABI-H0731可在單用NAs基礎(chǔ)上進(jìn)一步抑制病毒復(fù)制，發(fā)揮抗病毒作用。在后續(xù)的研究中，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)NAs聯(lián)用ABI-H0731是否可實(shí)現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答，上述201及202研究所有患者均開放標(biāo)簽進(jìn)行NAs聯(lián)合ABI-H0731至少治療24周，之后每4周對(duì)患者進(jìn)行評(píng)估，如果HBV DNA+pgRNA低于檢測下限并且HBeAg轉(zhuǎn)陰或≤5 IU/ml，即停止治療，否則，繼續(xù)治療。在202研究中，患者在入組后持續(xù)治療72周時(shí)間內(nèi)，雖然HBV DNA及pgRNA水平持續(xù)下降，但均未低于檢測下限。201研究中，最終共23例基線HBeAg(-)患者及18例基線HBeAg(+)患者達(dá)到停止治療標(biāo)準(zhǔn)停藥，并進(jìn)行了持續(xù)隨訪。然而隨后的數(shù)據(jù)表明，基線HBeAg(-)患者在停止治療后16周內(nèi)全部復(fù)發(fā)，基線HBeAg(+)患者在隨訪12周內(nèi)全部復(fù)發(fā)，Assembly Biosciences公司也因此于2021年9月份因該藥的Ⅱ期臨床研究未達(dá)到其預(yù)期的停藥終點(diǎn)而遺憾地宣告終止。另外兩種在研核衣殼抑制劑NVR3-778、JNJ56136379被報(bào)道可明顯降低HBV DNA及RNA水平，且下降具有相似的動(dòng)力學(xué)，但以血清中HBV DNA、HBV RNA作為患者病毒學(xué)應(yīng)答的評(píng)價(jià)指標(biāo)并停藥后，部分患者血清HBV DNA及RNA水平均出現(xiàn)反彈，甚至達(dá)到了基線水平[22-23]。CpAMs可干擾衣殼蛋白對(duì)pgRNA的包裝環(huán)節(jié)。因此，理論上ABI-H0731等CpAMs不僅可直接抑制上清中HBV DNA的水平，由于CpAMs同樣抑制了pgRNA包裹入核衣殼，從而也抑制了血清中HBV RNA的水平，這意味著在CpAMs治療下血清HBV DNA和(或)pgRNA水平均不能再反映患者cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性，這可能也是本研究中ABI-H0731以HBV DNA+pgRNA聯(lián)合作為患者停藥標(biāo)準(zhǔn)卻導(dǎo)致所有患者停藥后病毒學(xué)反彈的主要原因。

5 核衣殼抑制劑臨床試驗(yàn)及藥物評(píng)價(jià)指標(biāo)新建議

這些臨床試驗(yàn)的結(jié)果，使我們注意到CpAMs在臨床試驗(yàn)中如何選擇合適的病毒學(xué)指標(biāo)作為其合理停藥標(biāo)準(zhǔn)這一現(xiàn)實(shí)問題。目前，僅有肝活檢可準(zhǔn)確監(jiān)測肝內(nèi)cccDNA水平，但其有創(chuàng)性及操作后可能出現(xiàn)的并發(fā)癥限制了在常規(guī)臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。除HBV DNA和HBV RNA外，來源于cccDNA的其他病毒產(chǎn)物，還包括HBsAg及乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)。但由于HBsAg可來源于HBV基因組整合，此時(shí)HBsAg水平與cccDNA的相關(guān)性較差，因此并不能準(zhǔn)確反映cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性[24]。HBcrAg包括HBV核心抗原(HBV core antigen，HBcAg)、HBeAg及22 kDa的前核心蛋白(22 kDa precore protein，P22cr)，在CHB患者中，HBcrAg與cccDNA轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)[25-26]。從作用機(jī)制上，CpAMs可分為誘導(dǎo)異常組裝的衣殼的形成(Ⅰ類，雜芳基二氫吡啶類)或正常組裝的空衣殼形成(Ⅱ類，苯丙酰胺類及氨磺酰類)。前者通常在細(xì)胞內(nèi)降解，后者雖可釋放，但由于沒有病毒核酸，不具備感染性[9，27-28]。因此，我們推測，對(duì)于Ⅱ類CpAMs，血清HBcrAg消失或許能較好反映cccDNA轉(zhuǎn)錄靜默。據(jù)報(bào)道，通過熒光的生化衣殼組裝實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABI-H0731干預(yù)后快速產(chǎn)生了空衣殼結(jié)構(gòu)，且未出現(xiàn)HBc降解，屬于Ⅱ類CpAMs[29]。因此，基于其藥物作用機(jī)制，我們建議在臨床試驗(yàn)中，血清HBV DNA及HBV RNA聯(lián)用血清HBcrAg陰性作為停藥指標(biāo)，以提高停藥的安全性，但仍需要高質(zhì)量臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。而對(duì)于Ⅰ類CpAMs，由于其會(huì)組裝成異常衣殼并在胞內(nèi)降解，此情況下血清HBcrAg是否還能準(zhǔn)確地反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性存疑，未來應(yīng)考慮與其他血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)用來進(jìn)一步降低停藥后病毒學(xué)反彈的風(fēng)險(xiǎn)。

6 結(jié)語

目前，乙肝新藥的研發(fā)如火如荼，上述臨床研究案例提示我們，在不同機(jī)制的抗病毒藥物治療下，如何選用合適的指標(biāo)還需謹(jǐn)慎全面地進(jìn)一步總結(jié)。