王馨,劉健,文建庭,王杰,忻凌,萬磊,姜輝,孫玥，王桂珍，陳瑞蓮

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,合肥 230031

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以對(duì)稱性、多關(guān)節(jié)炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其在世界上的發(fā)病率為1%，患者多集中在40～60歲，嚴(yán)重威脅著人類健康，其具體發(fā)病機(jī)制不明[1]?；こ衫w維細(xì)胞(FLS)是RA病理變化過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞[2]。RA的病理機(jī)制主要體現(xiàn)在RA-FLS的凋亡逃逸和增殖過度[3]，也表現(xiàn)為凝血纖溶系統(tǒng)的失衡和機(jī)體的高凝狀態(tài)[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Lnc RNA)過去被認(rèn)為沒有編碼蛋白質(zhì)能力[5]，目前大量研究證實(shí)，lncRNA具有免疫調(diào)節(jié)等作用，參與RA的炎癥、凋亡等過程[6]。本團(tuán)隊(duì)前期通過高通量測(cè)序及GO分析研究，認(rèn)為L(zhǎng)ncRNA MIR22HG(MIR22HG)是參與RA凋亡的關(guān)鍵lncRNA，在RA患者體內(nèi)高表達(dá)[7]。

寒濕痹阻證是RA的常見證型之一[8]，RA寒濕痹阻證屬于中醫(yī)“寒痹”范疇，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)怕冷、酸痛不適，伴畏寒、乏力、疲倦、頭暈、食欲不振、腹瀉、腹脹、舌淡、苔薄白、脈細(xì)弱等癥狀[9]。劉健教授以新安醫(yī)學(xué)為指導(dǎo)，立足于臨床實(shí)踐，創(chuàng)制具有健脾化濕，溫陽通絡(luò)作用的中藥復(fù)方新風(fēng)膠囊(XFC，由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成，專利號(hào)：ZL201310011369.8，皖藥制字：Z20050062)和五味溫通除痹膠囊(WWT，由桂枝、淫羊藿、片姜黃、茯苓、黃芩組成。專利號(hào):ZL 20111 0095 704.8)長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，療效顯著[10]。XFC、WWT可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制高凝狀態(tài)[11-12]，XFC和WWT聯(lián)合使用可減輕RA關(guān)節(jié)癥狀，改善系統(tǒng)病變，改善患者感受[13]。但是RA寒濕痹阻證患者的MIR22HG表達(dá)和凋亡凝血指標(biāo)是否存在異常以及XFC和WWT聯(lián)合用藥對(duì)其的影響作用尚不明確。

回顧性數(shù)據(jù)挖掘是基于數(shù)據(jù)挖掘方法進(jìn)行的回顧性研究，其中包括頻數(shù)分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、相關(guān)性分析和隨機(jī)行走等方法[14]。

本文采用回顧性數(shù)據(jù)挖掘之關(guān)聯(lián)規(guī)則分析方法，觀察RA寒濕證患者M(jìn)IR22HG的表達(dá)及凋亡、凝血纖溶指標(biāo)的變化，研究XFC聯(lián)合WWT干預(yù)后對(duì)其的影響，為XFC聯(lián)合WWT的健脾化濕溫陽通絡(luò)法治療RA寒濕痹阻證臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中醫(yī)藥治療RA提供新的研究思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020年10月至12月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院RA住院患者100例，30例健康者來自同一醫(yī)院健康體檢中心。本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：2019AH-12)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 納入RA患者均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，辨證參照2018年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合診療指南[9]。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；使用XFC和WWT(服用方法：口服，3次/d，3粒/次)，同時(shí)治療方案中醫(yī)辨證論治[9]寒濕痹阻證，每日1劑，均以4周為一療程。治療藥物由本院藥學(xué)部和制劑室提供)，必要時(shí)可使用非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥；有完整的治療前后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有心、肝、腎等嚴(yán)重疾病以及嚴(yán)重關(guān)節(jié)外表現(xiàn)；年齡在18歲以下，75歲以上者；孕婦或哺乳期女性；精神病患者；關(guān)節(jié)嚴(yán)重畸形，完全喪失關(guān)節(jié)功能者；觀察期間應(yīng)用免疫抑制劑和生物制劑的患者。

1.4 分組及觀察指標(biāo) 選擇30例健康體檢人群為健康對(duì)照組，100例RA寒濕痹阻證患者治療前為RA寒濕組，經(jīng)治療為XFC+WWT組，比較RA寒濕組和健康對(duì)照組中MIR22HG水平、凝血和凋亡指標(biāo)。臨床指標(biāo)：LncRNA：MIR22HG；凝血指標(biāo)：血小板計(jì)數(shù)(PLT)、纖維蛋白原(FBG)、D-二聚體(D-dimer)、部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血小板活化因子(PAF)和前列腺素I2(PGI2)；凋亡指標(biāo)：B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白(Bax)和B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)。

1.5 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑：XFC、WWT(每粒均含生藥0.4g，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，ELISA試劑盒(JYM0155Hu，JYM0082Hu，武漢基因美生物科技公司)。

1.6 方法

1.6.1 回顧性數(shù)據(jù)挖掘 檢索自建數(shù)據(jù)庫2020年10月至12月的健脾化濕溫陽通絡(luò)法治療RA寒濕證的病例，采用頻數(shù)分析、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析等數(shù)據(jù)挖掘的方法分析總結(jié)健脾化濕溫陽通絡(luò)法對(duì)RA寒濕證化的治療作用。

1.6.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 采用SPSS Modeler 18.0 中的Aprior模塊分析XFC聯(lián)合WWT與MIR22HG、凋亡指標(biāo)及凝血指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性[17]?！坝小比≈刀椤癟”，“無”取值定為“F”。指標(biāo)改善定為“T”，指標(biāo)未改善定為“F”。包括補(bǔ)充缺失數(shù)據(jù)，剔除錯(cuò)誤數(shù)據(jù)。

1.6.3 相關(guān)性分析 采用Spearman 相關(guān)性分析分析MIR22HG與凋亡指標(biāo)和凝血纖溶指標(biāo)之間關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6.4 RT-qPCR檢測(cè)MIR22HG mRNA、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達(dá) Trizol提取各組總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳，采用Gelpro32凝膠圖像分析軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，以β-actin表達(dá)量為參照采用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物：MIR22HG正向引物為5′-AAGTGTGGCTCTGTGCCTAT-3′，正向引物為5′-ATCTTCAGGCCTTGCCTTCT-3′，β-actin正向引物為5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，正向引物為5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′。

1.6.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子PAF、PGI2的表達(dá) 收集各組培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心10min，棄去沉淀。將上清液加入酶標(biāo)板中(每孔100 μL)，37 ℃孵育1.5 h，采用 ELISA 方法，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的OD值，以上重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 RA寒濕痹阻證患者M(jìn)IR22HG、凝血和細(xì)胞凋亡指標(biāo)的變化 與健康對(duì)照組相比，RA寒濕組患者M(jìn)IR22HG、PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bcl-2升高，PGI2、Bax降低(P<0.05)。見表1。

表1 RA寒濕痹阻證患者M(jìn)IR22HG、凝血和凋亡指標(biāo)的變化

2.2 RA寒濕痹阻證MIR22HG與凋亡指標(biāo)和凝血指標(biāo)的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)BG、D-dimer、PLT、PGI2與MIR22HG呈正相關(guān)，APTT、Bax與MIR22HG呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖1。

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證患者M(jìn)IR22HG與凋亡指標(biāo)和凝血指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 RA寒濕痹阻證MIR22HG與凋亡、凝血指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 設(shè)定后項(xiàng)為MIR22HG，后項(xiàng)為凋亡、凝血指標(biāo)，最小支持度為20%，最小置信度為60%。經(jīng)Aprior 模塊分析，MIR22HG表達(dá)升高與Bax、APTT降低和PAF、D-dimer、FBG、Bcl-2和PLT升高的支持度大于45%、置信度均大于95%、提升度均大于1，具有關(guān)聯(lián)性。見表2。

表2 RA寒濕痹阻證患者M(jìn)IR22HG與凝血纖溶指標(biāo)和凋亡指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.4 RA寒濕痹阻證治療前后MIR22HG、凝血指標(biāo)及凋亡指標(biāo)的變化 與治療前相比，RA寒濕痹阻證患者治療后PGI2、Bax升高，PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bcl-2和MIR22HG降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。見表3。

表3 RA寒濕痹阻證治療前后凝血指標(biāo)及其余各指標(biāo)的變化

2.5 XFC+WWT與治療前后凝血指標(biāo)及其余各指標(biāo)改善的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 設(shè)定前項(xiàng)為XFC+WWT，后項(xiàng)為實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，最小支持度為20%，最小置信度為40%。經(jīng)Aprior 模塊分析，XFC+WWT與凝血指標(biāo)APTT、PAF、PGI2、D-dimer和凋亡指標(biāo)Bcl-2、Bax改善的支持度均大于40%、置信度均大于45%、提升度均大于1，具有關(guān)聯(lián)性。見表4，圖2。

表4 XFC+WWT與治療前后凝血指標(biāo)、凋亡指標(biāo)、MIR22HG改善的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

圖2 XFC+WWT與治療前后凝血指標(biāo)、凋亡指標(biāo)、MIR22HG改善的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析圖

3 討論

本研究以中醫(yī)學(xué)理論為指導(dǎo)，認(rèn)為RA寒濕證的中醫(yī)學(xué)病機(jī)類似于由基因調(diào)控導(dǎo)致的凋亡不足、高凝狀態(tài)的現(xiàn)代分子機(jī)制[18]。目前有許多關(guān)于lncRNA的研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)失調(diào)的lncRNAs可參與調(diào)節(jié)RA的免疫炎癥反應(yīng)和凋亡過程[19]。故以LncRNA和凋亡、凝血指標(biāo)為研究對(duì)象，基于回顧性數(shù)據(jù)挖掘方法探討中藥復(fù)方XFC+WWT治療RA寒濕證的研究。

目前國(guó)內(nèi)中醫(yī)學(xué)者治療RA寒濕痹阻證主要以標(biāo)本兼治為主，李彥民教授以溫陽補(bǔ)虛，清熱解毒之桂芍知母治尪湯治寒濕阻絡(luò)型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，促進(jìn)免疫活化，抑制炎癥反應(yīng)[20]。左瑞庭加味五痹湯聯(lián)合甲氨蝶呤治療寒濕痹阻型RA，可改善骨破壞、阻滯炎癥因子釋放、促進(jìn)氧自由基排除，明顯改善患者感受[21]。本研究針對(duì)RA寒濕痹阻證提出了健脾化濕，溫陽通絡(luò)的新安健脾系列方新風(fēng)膠囊、五味溫通除痹膠囊。本團(tuán)隊(duì)前期已分別對(duì)其開展了相關(guān)研究表明，新風(fēng)膠囊能不同程度改善RA寒濕癥狀，改善高凝狀態(tài)，改善RA關(guān)節(jié)癥狀[22]，五味溫通除痹膠囊能改善RA患者超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP-AB)及免疫球蛋白M(IgM)等免疫炎癥指標(biāo)[23]。但新風(fēng)膠囊聯(lián)合五味溫通除痹膠囊對(duì)RA寒濕證凋亡和凝血指標(biāo)的影響尚少報(bào)道。本文研究結(jié)果表明，RA寒濕痹阻證患者M(jìn)IR22HG過表達(dá)，與FBG、D-dimer、PLT、PGI2呈正相關(guān)，與APTT、Bax呈負(fù)相關(guān)，PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bax升高，PGI2、Bcl-2降低。XFC聯(lián)合WWT能下調(diào)MIR22HG的表達(dá)，同時(shí)也能降低PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bax，升高PGI2、Bcl-2。表明RA寒濕痹阻證患者存在MIR22HG基因高表達(dá)、凋亡逃逸和凝血纖溶系統(tǒng)的失衡狀態(tài)，XFC+WWT能降低高表達(dá)的MIR22HG，促進(jìn)凋亡、改善高凝狀態(tài)。

具有健脾化濕溫陽通絡(luò)之效的新風(fēng)膠囊和五味溫通除痹膠囊是國(guó)家發(fā)明專利產(chǎn)品?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，XFC中黃芪的有效成分三萜皂苷可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子caspase-3,Bax,Bcl-2的表達(dá)水平，細(xì)胞凋亡[24-26]。雷公藤可通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-28]。WWT中桂枝的活性成分桂皮油能擴(kuò)張血管，增強(qiáng)外周血液循環(huán)，延長(zhǎng)小鼠的出、凝血時(shí)間[29]。淫羊藿苷具有較好的抗炎、骨保護(hù)作用,能改善骨質(zhì)疏松,且還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的活性[30]。諸藥合用，能有效調(diào)節(jié)纖溶凝血系統(tǒng)失衡，促進(jìn)凋亡，改善RA患者癥狀，共奏健脾化濕，溫陽通絡(luò)之功。

然而，此研究尚存在許多不足，對(duì)于MIR22HG是如何調(diào)控凝血凋亡等指標(biāo)以及XFC聯(lián)合WWT是通過如何調(diào)控MIR22HG來影響凝血凋亡等指標(biāo)尚未深入研究。因此，下一步我們將從系統(tǒng)生物學(xué)方面，利用基因干擾和過表達(dá)技術(shù)，進(jìn)一步研究XFC+WWT治療RA寒濕痹阻證的機(jī)制。