書星，趙洋，孫敏，南玉奎，王慧琴，齊飛波

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，a 泌尿中心，b 科教中心，烏魯木齊 830002

原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)簡稱原醛癥，是由于腎上腺皮質球狀袋分泌過多的醛固酮所致。血漿中超出常規(guī)含量的醛固酮對腎臟、心臟、腦等器官有獨立于高血壓的損害作用[1]。PA的主要類型包括：雙側腎上腺增生(BAH)、醛固酮瘤(APA)、家族性醛固酮增多癥(FH)及腎上腺皮質癌[2-4]，發(fā)病機制尚不清楚。

microRNAs(miRNAs)是短鏈非編碼RNA的一種，其長度為18～27個核苷酸，在超過30%的人類基因中，與靶mRNA的3‘非翻譯區(qū)(3‘UTR)相結合，在轉錄后水平進行調節(jié)[5]。miRNAs參與了體內諸多的生物學進程[6]。miRNA功能異常會導致正常細胞過度增殖或癌變。在諸多致瘤miRNA中較為關鍵的是miR-21，其在多種腫瘤組織中均有高表達[7]。本研究通過對48例APA患者手術樣本進行分子生物學研究并構建細胞模型，探討miR-21在該疾病發(fā)生中的潛在分子生物學機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院2016年1月至2018年6月就診的48例腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤與瘤旁組織，并保存于液氮中；其中女性31例，男性17例；年齡范圍21～58歲，年齡(42.0±10.2)歲。腫瘤大小1.2～3.9 cm，平均2.26 cm。本研究方案經新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 試劑與材料 所有標本均經術后病理確診，從距離腫瘤手術陰性切緣1 cm以外的腎上腺中切取瘤旁組織。miR-21、U6引物(上海生工生物工程股份有限公司)；人腎上腺皮質細胞(HACC)259細胞(中國科學院上海生命科學研究院)；miR Neasy Mini kit試劑盒、QIAGE miScript Ⅱ RT Kit反轉錄試劑盒、QIAGE miScript Ⅱ RT Kit反轉錄試劑盒及QIAGEN miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒購自德國QIAGEN公司；無血清培養(yǎng)基(Opti-MEMI)、轉染試劑脂質體2000(Lipofectamine 2000)均購自美國Invitrogen公司；10%胎牛血清購自Gibco；miR-21抑制物(miR-21·INH載體)及對照空載體(INH-NC)購自上海Gene公司；RAS、PTEN活性檢測試劑盒(生工生物)、caspase-3檢測試劑盒；免疫組織化學相關試劑及材料有我院病理科提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 miR-21相對表達量檢測

1.3.1.1 提取總RNA 通過Trizol法抽提總RNA，取凍存組織塊30～50 mg研磨，按照德國QIAGEN有限公司產品miR Neasy Mini Kit試劑盒說明書進行樣本總RNA提取。最后用超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo 美國)測定提取樣本的總RNA濃度及純度，保存樣本備用。

1.3.1.2 逆轉錄合成cDNA 在逆轉錄合成cDNA時，參照德國QIAGE miScript Ⅱ RT Kit反轉錄試劑盒的說明書進行操作，反應體系為20 μL：5×HIFlex Buffer 4 μL，10×Nucleics Mix 2 μL，RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA(濃度約為25 ng/μL)+RNase-Free H2O2共12 μL。反應條件：37 ℃，60 min；95 ℃，5 min。

1.3.1.3 實時熒光定量PCR反應 采用QIAGEN miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒，反應體系20 μL：2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，10×miScript Primer Assay 2 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，RNase-Free H2O25 μL，模板cDNA 1 μL。MiR-21特異性引物及U6內參引物見表1。反應條件：95 ℃，15 min，1個循環(huán)。94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s；40個循環(huán)。分別計算miR-21及U6基因的Ct值，ΔCt值代表基因的相對定量，ΔCt值=目的基因Ct值-同組內參Ct值，ΔΔCt值=各樣本ΔCt值-最小ΔCt值，其表達的差異倍數用2-ΔΔCt值表示，實驗重復3次。

表1 miRNA-21及U6引物序列

1.3.2 免疫組織化學檢測PTEN、RASA1及caspase-3表達 采用SP法行免疫組織化學染色，PTEN細胞漿內黃染為陽性，RASA1細胞槳和胞核內黃染為陽性，caspase-3細胞核內黃染為陽性。隨機取5個高倍鏡(10×40)下視野，0分≤10%，1分為11%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為≥76%。染色強度0分無染色，1分淡染色，2分棕染色，3分棕褐色。陽性為兩項積分和≥3分，陰性<3分。

1.3.3 Western Blot法檢測RASA1、PTEN及caspase-3表達 采用Western Blot凝膠成像法對組織及細胞模型中的蛋白表達情況進行半定量分析。稱取相同質量組織樣本或吸取相同數量對數期培養(yǎng)細胞，對組織或細胞進行裂解并抽提獲得總蛋白，采用BCA法對蛋白進行定量，配平蛋白濃度，GAPDH為已知濃度標準蛋白對照，按照20 μL蛋白+5 μL蛋白上樣緩沖液混勻后置于金屬加熱器中100 ℃變性5 min。配置5%濃縮膠及12%分離膠，點樣后90 V電壓下電泳30 min，130 V電壓下電泳90 min，轉膜90 min，5%封閉液封閉2 h，孵育相應一抗于4 ℃過夜，TBST洗3次，每次洗10 min，加二抗孵育2 h，TBST洗3次，每次洗10 min，隨即使用凝膠成像儀拍照和分析結果，以GAPDH作為陽性對照，選用PTEN/GAPDH、RASA1/GAPDH及caspase-3/GAPDH的灰度比值來代表腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤組織與瘤旁組織或HACC細胞模型中的相應蛋白的相對含量。

1.3.4 HACC micR-21表達細胞系構建 (1)細胞培養(yǎng)：人腎上腺皮質細胞(HACC)細胞株HACC 259(購自北納生物)，細胞常規(guī)培養(yǎng)在10%新胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中置于5%二氧化碳、37 ℃飽和溫度的培養(yǎng)箱中。每48小時更換1次新鮮培養(yǎng)基并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。48～72 h用0.25%的胰蛋白酶消化傳代細胞1次，取對數生長期的細胞用于實驗。(2)細胞轉染：參照Lipofactamine 2000轉染試劑說明書，采用瞬時轉染法分別將miR-21高表達載體、miR-21抑制載體及空載體轉染入HACC細胞，建立穩(wěn)定表達細胞系，轉染后6 h換含10%小牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以用于后續(xù)實驗。

1.3.5 HACC模型細胞生長曲線繪制 采用MTT法觀察細胞生長情況，并繪制細胞生長曲線，具體如下：(1)制備1 mL細胞懸液，空白對照以1 mL培養(yǎng)基代替細胞懸液，加入0.1 mL MTT于37 ℃孵育4 h；(2)加1 mLDTW脫色液，37 ℃至少靜置30 min，時甲質顆粒充分溶解；(3)吸取200 μL上述溶解液至96孔板中，在酶標儀上讀取光密度(OD)值，檢測波長570 nm，參考波長630 nm；(4)每隔48 h測量1個點，每個點平行測量3次取平均值；(5)按照OD值隨時間的變化情況繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 miRNA-21在腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織中的表達

2.1.1 miRNA-21實時熒光定量PCR檢測結果 使用U6基因作為內參基因，腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤組織與瘤旁組織樣本中miR-21的熒光定量擴增曲線呈現為典型的S型平滑曲線，該結果說明此次熒光定量試驗反應的擴增效率良好；溶解曲線呈現為單峰，說明此次熒光定量實驗反應的特異性擴增良好。

2.1.2 miR-21的相對表達水平 通過2-ΔΔCt法計算腎上腺醛固酮瘤患者的瘤旁組織與腫瘤組織樣本中miR-21相對內參U6的相對表達量。miR-21在腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤組織(0.109±0.050)中的表達量高于瘤旁組織(0.040±0.019)，差異有統計學意義(t=9.184，P<0.001)。

2.2 PTEN蛋白、RASA1蛋白及caspase-3蛋白在腎上腺醛固酮瘤癌組織與癌旁組織中的表達

2.2.1 RASA1 在腎上腺醛固酮瘤旁組織中陽性表達率為60.41%(29/48)，主要腎上腺細胞漿中；腎上腺瘤患者組陽性表達率為8.33%(4/48)，主要在細胞漿中。兩組比較，差異有統計學意義(χ2=28.860，P<0.001)(圖1)。

圖1 腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織RASA1免疫組織化學結果:A為RASA1陽性表達(IHC×100)；B為RASA1陰性表達(IHC×100)

2.2.2 caspase-3 caspase-3在兩組中均有陽性表達，陽性表達定位于細胞核。在腎上腺醛固酮瘤旁組織中陽性表達率為89.58%(43/48)；腎上腺醛固酮瘤組織中的陽性表達率為25.00%(12/48)，兩組比較，差異有統計學意義(χ2=18.447，P<0.001)(圖2)。

圖2 腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織caspase-3免疫組織化學結果：A為caspase-3陽性表達(IHC×100)；B為caspase-3陰性表達(IHC×100)

2.2.3 PTEN PTEN在腎上腺醛固酮瘤組織與腎上腺醛固酮瘤旁組織中均有陽性表達，陽性表達定位于細胞漿；在腎上腺醛固酮瘤旁組織中陽性表達率為85.42%(41/48)；腎上腺醛固酮瘤組織陽性表達率為22.92%(11/48)(圖3)。兩組間差異有統計學意義(χ2=37.762，P=0.001)。

圖3 腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織PTEN免疫組織化學結果：A為PTEN陽性表達(IHC×200)；B為PTEN陰性表達(IHC×200)

2.3 HACC細胞培養(yǎng)結果 轉染HACC細胞后，Western Blot表達量檢測結果顯示，通過LSD法進行組間比較可知：轉染細胞使miR-21過表達時caspase-3蛋白表達量(0.531±0.008)與轉染細胞miR-21抑制表達時caspase-3蛋白表達量(0.279±0.003)與陰性對照組(0.422±0.006)比較，差異有統計學意義(P=0.001)；miR-21抑制表達組與miR-21過表達組caspase-3蛋白表達量差異有統計學意義(P=0.001)。

轉染后的HACC進行細胞生長分析，結果顯示：與陰性對照相比，miR-21抑制表達組細胞生長緩慢，生長受到抑制；miR-21過表達組細胞生長迅速，細胞呈現過度增殖趨勢(圖4)。

圖4 HACC生長曲線

3 討論

miR-21是在多種人類腫瘤中表達呈上調趨勢的一個公認的非常重要的致癌基因[8]。目前已知miR-21的調控靶基因包括：PTEN[9]、RASA1[10]、caspase-3[11]等。

PTEN基因編碼的蛋白可以使三磷酸肌醇去磷酸化而負調節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路[12],引起細胞異常增殖[13]。PTEN的表達下調或突變失活間接激活mTORM通路誘導腫瘤的發(fā)生及進展，而PTEN是miR-21的靶基因，可通過對PTEN的調節(jié)誘發(fā)腫瘤或導致腫瘤進展[14]。Ras基因是保守的抑癌基因，RASA1是最早被發(fā)現的RAS GAPs之一。caspase-3是caspase家族中最為重要的成員，調控細胞的凋亡。caspase-3的低表達會導致細胞產生抗凋亡特性而導致腫瘤的發(fā)生[15]。研究[16]表明，miR-21在多種腫瘤中的表達中呈現上調趨勢，其可同時對多種蛋白進行調控，造成細胞增殖代謝紊亂，PTEN、RASA1及caspase-3是其重要的靶向基因。

本研究發(fā)現：(1)miR-21在腎上腺醛固酮瘤組織中的表達明顯高于瘤旁組織，通過免疫組織化學試驗顯示，瘤組織中的PTEN、RASA1及caspase-3蛋白的表達均較瘤旁組織呈現下調趨勢，表明瘤組織中miR-21的上調可能與PTEN、RASA1及caspase-3表達存在負向調節(jié)關系。(2)miR-21抑制及過表達的HACC細胞模型，研究結果顯示，miR-21過表達組中caspase-3蛋白表達量與miR-21抑制組比較，差異有統計學意義；miR-21抑制組細胞生長受到抑制，而miR-21過表達組細胞呈現過度增長態(tài)勢，表明miR-21可能通過調控caspase-3蛋白的表達來降低細胞凋亡，導致腫瘤發(fā)生。

綜上所述，腎上腺醛固酮瘤中miR-21呈現高表達，通過下調RASA1、PTEN及caspase-3，從而抑制細胞凋亡參與腫瘤進展。