王麗華，甘 君，陳善波，王 莎，金銀春，楊柳璐，羅德智，羅成榮，陳 劉，楊曉蓉，吳 斌

（1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081；2.四川省花椒工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610081；3.鄰水縣萬峰山國有林場，四川 鄰水 635303；4.丹棱縣旺源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，四川 丹棱 620200）

藤椒為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）竹葉花椒（Zanthoxylum armatumDC.）中的栽培品種，是集香料、調(diào)料、油料、醫(yī)用等為一體的特色經(jīng)濟(jì)林樹種。藤椒具有口味清爽、香味濃郁、麻味綿長、回味不苦等特點(diǎn)，作為花椒中的一枝新秀，比青花椒更受川菜的青睞，其系列產(chǎn)品逐漸被更多的食客接受和喜愛[1-4]。同時，藤椒還具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等作用，現(xiàn)廣泛用于中醫(yī)藥的研究和產(chǎn)品開發(fā)，具有廣闊的發(fā)展前景[5-9]。

目前，生產(chǎn)中廣泛栽培的常規(guī)藤椒為實(shí)生多刺品種，其主干、枝條及葉片均密生皮刺，皮刺的特殊性導(dǎo)致其果實(shí)采摘主要依靠人工，費(fèi)時費(fèi)力勞動強(qiáng)度大，且容易扎傷，而花椒機(jī)械化采摘技術(shù)目前在生產(chǎn)中應(yīng)用尚不成熟，導(dǎo)致藤椒種植比較效益相對較低，阻礙了產(chǎn)業(yè)發(fā)展，影響了椒農(nóng)的種植積極性。因此，培育少刺藤椒新材料成為解決果實(shí)采收難、采摘成本高等突出生產(chǎn)問題的主要途徑之一。項(xiàng)目組通過多年的持續(xù)研究，培育出了葉片及葉軸均為無刺，枝條皮刺小、數(shù)量少、刺間距大，且豐產(chǎn)的少刺藤椒優(yōu)良品系[3]。

揮發(fā)性化學(xué)成分是植物體內(nèi)的次生代謝物，為多種類型化合物的總稱，又稱為揮發(fā)油，在楠木、西南樺、龍腦樟、花椒等樹種中研究較多[10-14]。揮發(fā)油是藤椒重要的生物活性組分之一，也是藤椒果實(shí)香氣和特殊風(fēng)味的主要成分來源[7]。近年來，國內(nèi)對于無刺或少刺花椒的研究主要集中在種質(zhì)資源收集與利用、栽培與繁育等方面[15-18]，對常規(guī)藤椒在果實(shí)揮發(fā)油含量、酰胺類物質(zhì)組分等方面已開展了相關(guān)研究[19-21]，但對于少刺藤椒品系果實(shí)揮發(fā)性成分的研究未見報道。本研究采用GC-MS對少刺藤椒優(yōu)良品系鮮椒果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，揭示基于刺的多寡不同品系藤椒在果實(shí)揮發(fā)油含量、揮發(fā)性主要成分及其相對含量方面的差異，為少刺藤椒新品種的創(chuàng)制及應(yīng)用推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為商品成熟期（6月下旬—7月上旬）的藤椒新鮮果實(shí)，所有樣品均采自于綿陽市鹽亭縣，YTCJ1和YTCJ2為選育的少刺藤椒優(yōu)良品系，CK為常規(guī)藤椒（多刺）。藤椒鮮果采集后，加冰袋放入泡沫盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器和試劑

HP 6890/5973 GC-MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國惠普科技有限公司；水蒸氣蒸餾裝置（包括電熱煲、三口圓底燒瓶、攪拌器、鐵架臺、溫度計、磨口錐形燒瓶、牛角塞、25 mL直型冷凝管等），蒸餾水，自備。

1.3 試驗(yàn)方法

揮發(fā)油含量采用水蒸氣蒸餾法；揮發(fā)性成分及相對含量采用無水乙醇萃取、氣質(zhì)聯(lián)用分析法，參照《化學(xué)試劑 氣相色譜法通則標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T 9722—2006）和《質(zhì)譜分析方法通則》（GB/T 6041—2020）執(zhí)行[22-23]。

1.3.1 揮發(fā)油含量測定

取100 g鮮藤椒果實(shí)（含種子），采用粉碎機(jī)打碎，放入三口圓底燒瓶內(nèi)，再加入300 mL蒸餾水，置于水蒸氣蒸餾裝置中蒸餾1 h。錐形瓶收集的蒸餾出液體出現(xiàn)明顯的分層，上層為無色透明的油相，下層為水相，用分液漏斗分離上層餾出液，待冷卻至室溫后，測定揮發(fā)油體積，精確至0.01 mL。

1.3.2 揮發(fā)性成分及相對含量測定

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm，100%聚乙二醇固定相）彈性石英毛細(xì)管柱；程序升溫，起始柱溫60 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升至120 ℃；然后以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min；FID檢測器溫度290 ℃，汽化室溫度為270 ℃；載氣為高純氮?dú)猓兌?9.999%），載氣流量為1.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，線速度31 cm/s，分流比25∶1。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度220 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍35～500 m/z。得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用NIST05版標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動檢索和匹配，確定揮發(fā)油的化學(xué)成分。采用峰面積歸一化法進(jìn)行揮發(fā)性成分的定量分析，計算各組分在揮發(fā)油中的相對百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油含量比較

由表1可知，不同品系藤椒果實(shí)揮發(fā)油含量存在一定差異，揮發(fā)油含量范圍為2.80～3.20 mL·100g-1，YTCJ1和YTCJ2揮發(fā)油含量均高于CK，揮發(fā)油含量提高14.28%。由此可見，選育的少刺藤椒優(yōu)良品系在皮刺減少的情況下，果實(shí)總揮發(fā)油含量并未隨之減少，具有比常規(guī)藤椒略高的揮發(fā)油含量。

表1 不同品系藤椒果實(shí)揮發(fā)油含量Table 1 Fruit volatile oil content in different strains of Z.armatum DC.

2.2 揮發(fā)性GC-MS總離子流圖比較

藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分總離子流圖見圖1～3。結(jié)果表明，3個不同品系藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分出峰時間較為集中，主要集中在前32 min出峰，說明藤椒揮發(fā)油中沸點(diǎn)較低的成分占比較大，這也為藤椒風(fēng)味物質(zhì)系列產(chǎn)品的合理開發(fā)利用提供了研究基礎(chǔ)。

圖1 YTCJ1揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of volatile components in YTCJ1

圖2 YTCJ2揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion flow diagram of volatile components in YTCJ2

圖3 CK揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion flow diagram of volatile components in CK

2.3 揮發(fā)性成分分析

少刺藤椒和常規(guī)藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分及相對含量見表2。不同品系藤椒鑒定出的成分峰面積之和均占其揮發(fā)性成分總峰面積的99.99%以上，3個品系的藤椒共鑒定出54種成分，其中：YTCJ1鑒定出揮發(fā)性成分49種，相對含量大于1.00%的揮發(fā)性物質(zhì)有12種，按相對含量從高到低依次為芳樟醇（35.41%）、檸檬烯（18.34%）、側(cè)柏烯（12.33%）、月桂烯（4.30%）、奎寧酸（3.93%）、泡桐素（3.00%）、亞油酸乙酯（2.18%）、亞麻酸乙酯（2.06%）、硼酸（1.78%）、α-亞麻酸（1.72%）、大根香葉烯（1.71%）、苦味素（1.94%）；YTCJ2鑒定出揮發(fā)性成分33種，相對含量大于1.00%的揮發(fā)性成分有12種，按相對含量從高到低依次為芳樟醇（24.76%）、桉油精（17.88%）、側(cè)柏烯（14.71%）、檸檬烯（14.06%）、α-松油醇（4.39%）、月桂烯（3.23%）、硼酸（2.53%）、α-蒎烯（2.06%）、亞油酸乙酯（2.04%）、亞麻酸乙酯（1.95%）、苦味素（1.85%）、α-亞麻酸（1.17%）；CK鑒定出揮發(fā)性成分41種，相對含量大于1.00%的揮發(fā)性成分有12種，按相對含量從高到低依次為芳樟醇（33.64%）、檸檬烯（14.19%）、側(cè)柏烯（12.00%）、1,8-桉葉素（9.86%）、月桂烯（3.36%）、奎寧酸（2.81%）、亞麻酸乙酯（2.35%）、亞油酸乙酯（2.32%）、硼酸（1.82%）、苦味素（1.71%）、α-亞麻酸（1.5%）、大根香葉烯（1.29%）。由此可見，YTCJ1揮發(fā)性成分中的芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯和月桂烯相對含量均高于CK，比CK分別提高5.26%、29.24%、2.75%和27.98%；YTCJ2揮發(fā)性成分中的桉油精為特有物質(zhì)，為17.88%。

表2 3個不同品系藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分及其相對含量?Table 2 Volatile composition and relative content in three different strains fruit of Z.armatum DC.

續(xù)表2Continuation of table 2

3個不同品系藤椒果實(shí)鑒定出共有揮發(fā)性成分27種，主要為醇類和烯烴類化合物，分別為α-崖柏烯（0.17%～0.22%）、α-蒎烯（0.44%～2.06%）、側(cè)柏烯（12.00%～14.71%）、β-蒎烯（0.49%～0.80%）、月桂烯（3.23%～4.30%）、檸檬烯（14.06%～18.34%）、β-羅勒烯（0.44%～0.91%）、反式香檜烯水合物（0.63%～0.65%）、芳樟醇（24.76%～35.41%）、十六十八醇（0.15%～0.36%）、桃金娘醇（0.13%～0.52%）、α-松油醇（0.35%～4.39%）、β-石竹烯（0.30%～0.82%）、大根香葉烯（0.98%～1.71%）、二環(huán)大根香葉烯（0.36%～0.84%）、波旁醇（0.14%～0.32%）、奎寧酸（0.57%～2.81%）、棕櫚酸（0.11%～0.38%）、9-十六碳烯酸乙酯（0.12%～0.33%）、棕櫚酸乙酯（0.21%～0.44%）、油酸（0.25%～0.29%）、植醇（0.74%～0.84%）、α-亞麻酸（1.17%～1.72%）、亞油酸乙酯（2.04%～2.32%）、亞麻酸乙酯（1.95%～2.35%）、硼酸（1.78%～2.53%）、苦味素（1.71%～1.94%）。共有成分中，各成分間的相對含量差異較大，其中芳樟醇、檸檬烯和側(cè)柏烯這3種共有成分的峰面積之和分別占YTCJ1、YTCJ2和CK揮發(fā)性成分總峰面積的66.08%、53.53%和59.83%，均達(dá)到其總峰面積的一半以上，進(jìn)一步說明了芳樟醇、檸檬烯和側(cè)柏烯是藤椒果實(shí)的主要揮發(fā)性成分。

鑒定出的54種藤椒果實(shí)揮發(fā)性化學(xué)成分，包括醇類、烯烴類、羧酸類、酮類、醛類和木脂素類等化合物，不同品系藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分及含量差異較大。與CK相比，YTCJ1鑒定出9種特有化學(xué)成分，分別為泡桐素（3.00%）、芝麻素（0.31%）、N-甲基-L-脯氨酸（0.26%）、α-異松油烯（0.16%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（0.13%）、雙環(huán)烯（0.12%）、薄荷酮（0.09%）、香茅醇（0.06%）和欖香醇（0.06%），9種成分的峰面積之和占YTCJ1揮發(fā)性成分總峰面積的4.19%；YTCJ2鑒定出2種特有化學(xué)成分，分別為桉油精（17.88%）、水菖蒲烯（0.40%），2種成分的峰面積之和占YTCJ2揮發(fā)性成分總峰面積的18.28%；CK鑒定出1,8-桉葉素（9.86%）1種特有化學(xué)成分。

3 結(jié) 論

1）本研究通過對不同品系藤椒鮮果果實(shí)揮發(fā)油含量分析，結(jié)果表明，少刺藤椒YTCJ1和YTCJ2的揮發(fā)油含量均為3.20 mL·100g-1，比CK提高14.28%。對以揮發(fā)油含量作為品質(zhì)評判標(biāo)準(zhǔn)的藤椒來說，選育出的少刺藤椒優(yōu)良品系在皮刺減少的情況下，果實(shí)總揮發(fā)油含量并未隨之減少，具有比常規(guī)藤椒略高的揮發(fā)油含量，具有推廣的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2）3個品系藤椒揮發(fā)性成分總離子流出峰時間主要集中在前32 min，說明藤椒揮發(fā)油中沸點(diǎn)較低的成分占比較大。

3）3個品系的藤椒共鑒定出54種揮發(fā)性成分，其中YTCJ1鑒定出49種，YTCJ2鑒定出33種，CK鑒定出41種，三者相對含量大于1.00%的揮發(fā)性成分均為12種；3個品系的藤椒鑒定出共有成分27種，主要為醇類、烯烴類等化合物，其中芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯3種成分的峰面積之和分別占YTCJ1、YTCJ2和CK揮發(fā)油成分總峰面積的66.08%、53.53%和59.83%，是藤椒果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分。

4）YTCJ1鑒定出9種特有化學(xué)成分，分別為泡桐素（3.00%）、芝麻素（0.31%）、N-甲基-L-脯氨酸（0.26%）、α-異松油烯（0.16%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（0.13%）、雙環(huán)烯（0.12%）、薄荷酮（0.09%）、香茅醇（0.06%）和欖香醇（0.06%），9種成分的峰面積之和占YTCJ1揮發(fā)性成分總峰面積的4.19%；YTCJ2鑒定出2種特有化學(xué)成分，分別為桉油精（17.88%）、水菖蒲烯（0.40%），2種成分的峰面積之和占YTCJ2揮發(fā)性成分總峰面積的18.28%；CK鑒定出1,8-桉葉素（9.86%）1種特有化學(xué)成分。

4 討 論

花椒作為香辛植物，含有包括揮發(fā)油、酰胺類物質(zhì)、生物堿、香豆素和脂肪酸等多種風(fēng)味成分，體現(xiàn)其“香”味的成分主要為揮發(fā)油[24-27]。揮發(fā)油含量是評價花椒內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，在花椒產(chǎn)品分級和銷售中具有重要作用。藤椒因其特殊的麻香味在竹葉花椒中獨(dú)樹一幟，以鮮藤椒為原材料生產(chǎn)的保鮮藤椒、藤椒油及藤椒風(fēng)味零食等產(chǎn)品廣受市場青睞，因此，揮發(fā)油含量的高低直接影響藤椒品質(zhì)、風(fēng)味及生產(chǎn)成本。趙志峰等[19]通過對藤椒揮發(fā)性成分分析，揮發(fā)性成分總離子流圖的出峰時間主要在前34 min，共鑒定出主要化學(xué)成分有27種，其中主要成分為芳樟醇（52.17%）、檸檬烯（18.87%）、檜烯（11.88%）、月桂烯（3.88%）、大根香葉烯（1.26%）和β-石竹烯（1.17%）。祝磊等[21]通過對不同形態(tài)商品藤椒揮發(fā)性成分分析，結(jié)果表明，鮮藤椒風(fēng)味最佳，保鮮藤椒次之，干藤椒再次之，褐變藤椒最差，4種藤椒揮發(fā)性成分總離子流圖的出峰時間主要集中在前30 min，共鑒定出42種化合物，主要為芳樟醇、檸檬烯、檜烯、β-水芹烯等烯烴類與醇類化合物，且以芳樟醇含量最高。本研究藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分以芳樟醇、檸檬烯為主，且芳樟醇相對含量最高，與上述研究結(jié)果一致，也與竹葉花椒[28]的相關(guān)研究結(jié)果近似。本研究芳樟醇相對含量、主要揮發(fā)性成分種類及含量與前人研究結(jié)果存在一定差異，這可能與藤椒品種特性、生長環(huán)境、栽培管理方式以及揮發(fā)性成分提取方法有關(guān)。蔣燕等[29]采用不同方法提取冷榨藤椒油樹脂發(fā)現(xiàn)，以超聲波輔助提取得到的成分種類最多，其特征風(fēng)味成分的相對含量也最高（檸檬烯4.52%，芳樟醇63.07%），水浴次之，微波提取的成分種類及相對含量均最低。胡強(qiáng)等[30]采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法對兩種生產(chǎn)工藝藤椒油產(chǎn)品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，傳統(tǒng)油浸法提取的藤椒油產(chǎn)品中特有揮發(fā)性成分有6種，超臨界-CO2-萃取法提取的藤椒油產(chǎn)品特有的揮發(fā)性成分有11種。

芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯和月桂烯均屬于單萜類化合物，其中芳樟醇是花椒中重要的香味物質(zhì)之一，具有濃青帶甜的木青氣息、花香、木香、果香，香氣柔和、清揚(yáng)透發(fā)，檸檬烯具有果香、有類似檸檬的香味，側(cè)柏烯具有木香的特點(diǎn)，月桂烯具有蠟香、青香、木香、果香等香味[31]。本研究中，不同品系藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分及相對含量差異較大，YTCJ1揮發(fā)性成分中芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯和月桂烯相對含量較CK分別提高5.26%、29.24%、2.75%和27.98%，且鑒定出9種特有化學(xué)成分。桉油精屬于單萜類化合物，味辛冷，有與樟腦相似的氣味，具有解熱、消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用，YTCJ2鑒定出2種特有化學(xué)成分且桉油精含量高達(dá)17.88%。本研究發(fā)現(xiàn)少刺藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分的種類和含量與常規(guī)藤椒存在一定差異，這可能與品種特性、不同砧木多次嫁接的種質(zhì)創(chuàng)制方法有關(guān)，下一步將擴(kuò)大篩選范圍對不同區(qū)域、不同砧穗組合藤椒果實(shí)揮發(fā)性成分種類及含量進(jìn)行研究。同時，基于已選育出的2個少刺藤椒品系的揮發(fā)油成分種類及含量，也為下一步以藤椒風(fēng)味物質(zhì)衍生產(chǎn)品研發(fā)為目標(biāo)的藤椒定向選育及培育提供方向。