范世成，朱元全，馮偉，李勝斌，王波，唐香，崔慶鵬*

(云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011；2.曲靖市第二人民醫(yī)院，云南 曲靖 655500)

0 引言

腎臟作為機(jī)體的高灌注器官，腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是臨床上急性腎功能衰竭(Acute renal failure,ARF)的重要環(huán)節(jié)，也是腎臟遠(yuǎn)期纖維化導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因[1,2]。目前缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，通常認(rèn)為：氧自由基、鈣超載、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞凋亡及多種信號通路參與了IRI的病理演變過程[3]。但隨著研究的深入，細(xì)胞能量代謝障礙及由此導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要原因。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，首先感受到能量的變化從而影響各種凋亡蛋白的表達(dá)，在缺血再灌注損傷中扮演著重要角色，因而成為目前研究缺血再灌注損傷的熱點[4-6]。 線粒體功能的表達(dá)是通過位于線粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性孔道線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)來實現(xiàn)的，MPTP是維持線粒體穩(wěn)定及細(xì)胞功能的必要條件，是線粒體與細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)的重要通道[7]。

親環(huán)蛋白D(Cyclophilin D,Cyp-D)屬于肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl-cis-transisomerases,PPIase)親環(huán)蛋白家族，是Ppif基因編碼的產(chǎn)物，主要定位于線粒體基質(zhì)，是構(gòu)成 MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子，在細(xì)胞凋亡及蛋白翻譯、折疊、運輸過程中起重要作用[8]。大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)，CYP-D是引起細(xì)胞死亡的關(guān)鍵性損傷蛋白，是反應(yīng)線粒體損傷及功能障礙的指標(biāo)。CYP-D表達(dá)水平與MPTP開放數(shù)量呈顯著正相關(guān)，CYP-D過度表達(dá)促進(jìn)MPTP開放，組織損傷加重，而通過基因敲除或使用免疫抑制劑環(huán)孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)能抑制CYP-D表達(dá)或活性，從而減少MPTP開放，減輕組織損傷，從而認(rèn)為CYP-D是抑制缺血再灌注損傷的重要靶點。

Caspase家族是存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡最重要的蛋白酶，與線蟲(caenorbditis elegans)的死亡基因Ced-3同源，根據(jù)其在細(xì)胞凋亡過程中的結(jié)構(gòu)及功能，分為炎癥有關(guān)、凋亡啟動及凋亡效應(yīng)三個亞類，其中Caspase-3是主要的凋亡效應(yīng)蛋白，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，Caspase-3一旦活化，凋亡必然發(fā)生[9]。

我們通過采用不同熱缺血時間建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，通過親環(huán)蛋白D介導(dǎo)的線粒體功能障礙研究腎臟IRI的作用機(jī)制，以及與Caspase-3的探明作用關(guān)系，同時作為MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子CYP-D，可能是抑制缺血再灌注損傷的作用靶點，將為臨床防止腎臟IRI和藥物研究提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康成年雄性SD大鼠40只、無創(chuàng)血管夾、兔抗小鼠Cyp-D一抗、兔抗小鼠caspase-3一抗、組織線粒體分離試劑盒、Trizol PCR 試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為4個組：假手術(shù)組(Con組)、I-R20min組、I-R30min組和I-R45min組，每組10只，每組于2個時間點(再灌注后24h及28d)處死取腎，每個時間點5只，共有8個小組。

1.2.2 模型建立

實驗組通過手術(shù)暴露雙側(cè)腎蒂后用無創(chuàng)血管夾夾閉，根據(jù)不同亞組時間分別阻斷(20分鐘、30分鐘、45分鐘)，恢復(fù)血供后可見腎臟迅速恢復(fù)鮮紅色，造模成功。假手術(shù)組僅游離腎蒂，但不夾閉腎蒂，其余操作方法相同。造模成功24h及28d后，切取腎臟行矢狀位切，放入液氮中速凍后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于Western blot及RT-PCR檢測。

1.2.3 Western blot

取腎組織線粒體，加入適量勻漿緩沖液(每100mg加入1mL緩沖液)于冰上勻漿10min，經(jīng)6000×g離心5min離心后取上清液，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒經(jīng)紫外可見分光光度計測定蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，然后分別用非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對其進(jìn)行孵育、檢測。

1.2.4 RT-PCR

用Trizol提取組織樣本中總RNA。取5μLRNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測RNA的完整性。用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyp-D 及Caspase-3的Western blot 檢測結(jié)果

圖2 Western blot 檢查不同熱缺血時間大鼠腎缺血再灌注28d Cyp-D及Caspase-3蛋白的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

圖4 不同熱缺血時間大鼠腎再灌注28d Cyp-D、Caspase-3 mRNA的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

Cyp-D的Western blot 檢測結(jié)果示，Con組Cyp-D含量少，隨缺血時間延長表達(dá)增加。與Con組比較，I-R20min組Cyp-D表達(dá)上未見明顯差異(P＞0.05)，I-R30min組與I-R45min組表達(dá)增加(P＜0.05)且I-R45min組增加明顯(見圖1、2)。Caspase-3的Western blot檢測結(jié)果示，Con組Caspase-3含量少，隨缺血時間延長表達(dá)增加。與Con組比較，I-R20min組Cyp-D表達(dá)上未見明顯差異(P＞0.05)，I-R30min組與I-R45min組表達(dá)增加(P＜0.05)且I-R45min組增加明顯(見圖1、2)。

圖1 Western blot 檢查不同熱缺血時間大鼠腎缺血再灌注24h Cyp-D及Caspase-3蛋白的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

2.2 Cyp-D 及Caspase-3的RT-PCR檢測結(jié)果

Cyp-D 及Caspase-3的RT-PCR檢測結(jié)果示，Con組Cyp-D及Caspase-3 mRNA含量少，隨缺血時間延長表達(dá)增加。與Con組比較，I-R20min組Cyp-D及Caspase-3 mRNA表達(dá)上未見明顯差異(P＞0.05)，I-R30min組與I-R45min組表達(dá)增加(P＜0.05)且I-R45min組增加明顯(圖3、4)。

圖3 不同熱缺血時間大鼠腎再灌注24h Cyp-D、Caspase-3 mRNA的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

3 討論

腎臟作為機(jī)體的高灌注器官，在器官移植、阻斷腎臟血流的手術(shù)、休克、心肺復(fù)蘇等中IRI均不可避免[10]，是臨床上急性腎功能衰竭的重要環(huán)節(jié)，也是腎臟遠(yuǎn)期纖維化導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因[1,2]。因此盡早恢復(fù)組織灌流是減少缺血性腎損傷的根本措施，但在臨床實踐中，為了保證手術(shù)治療目的，常需阻斷腎臟血流，所以對腎臟組織無明顯影響的熱缺血時間一直是泌尿外科及器官移植鄰域的研究熱點，但由于選用動物模型、實驗條件及檢測指標(biāo)的不同，得出的結(jié)論不完全一致，甚至相互矛盾，且大多數(shù)實驗未能使用同一指標(biāo)同時研究IRI對腎臟近期及遠(yuǎn)期損傷的影響，因此仍有必要研究IRI對腎臟組織細(xì)胞的影響并探討安全的熱缺血時間。隨著研究的深入，細(xì)胞能量代謝障礙及由此導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要原因。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，首先感受到能量的變化從而影響各種凋亡蛋白的表達(dá)，在缺血再灌注損傷中扮演著重要角色，因而成為目前研究缺血再灌注損傷的熱點[4-6]。線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化、呼吸鏈電子傳遞、合成ATP的重要場所，其功能的表達(dá)是通過位于線粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性孔道線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)來實現(xiàn)的，親環(huán)蛋白D(CyP-D)是構(gòu)成 MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子，在細(xì)胞死亡及蛋白翻譯、折疊、運輸過程中起重要作用[8]，是反應(yīng)線粒體結(jié)構(gòu)及功能障礙的指標(biāo)。本實驗中，無論再灌注早期及遠(yuǎn)期均可發(fā)現(xiàn)，隨缺血時間延長，Cyp-D蛋白及mRNA的表達(dá)均有不同程度升高，且Cyp-D在蛋白翻譯及所編碼基因轉(zhuǎn)錄水平上的結(jié)果是一致的，與Con組及I-R20min組比較，I-R30min組Cyp-D蛋白及mRNA的表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且I-R45min組表達(dá)明顯增加。這與劉長濤等[11]、斯妍娜等[12]在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中得到的結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)隨缺血時間延長，Cyp-D水平逐漸升高，MPTP的開放程度也相應(yīng)增加，腎組織損傷加重，通過抑制Cyp-D的表達(dá)，可發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。而通過敲除、沉默Ppif基因[13-17]或使用免疫抑制劑環(huán)孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)[18-21]能抑制CYP-D表達(dá)或活性，減少MPTP開放，減輕組織損傷，從而認(rèn)為CYP-D是抑制缺血再灌注損傷的重要靶點。所以CYP-D可作為反應(yīng)缺血再灌注損傷程度的指標(biāo)，其理由如下：

(1)缺血再灌注時，Ca+ 超載及大量ROS形成，ATP酶活性降低，ATP合成受阻，導(dǎo)致線粒體通透性改變及線粒體腫脹。線粒體結(jié)構(gòu)及功能的破壞，是細(xì)胞再灌注不可逆損傷的重要標(biāo)志。

(2)線粒體功能的表達(dá)是通過MPTP來實現(xiàn)的，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死常取決于MPTP開放的程度及持續(xù)時間的長短，MPTP短暫少量開放，引起細(xì)胞凋亡，而嚴(yán)重持續(xù)的開放則導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

(3)CYP-D作為MPTP的關(guān)鍵性調(diào)控因子，其表達(dá)水平與MPTP開放數(shù)量呈顯著正相關(guān)，Cyp-D水平升高，MPTP的開放程度也相應(yīng)增加，腎組織損傷加重，通過抑制Cyp-D的表達(dá)，可發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用，這在很多動物實驗中均可發(fā)現(xiàn)。

(4)通過敲除、沉默Ppif基因或使用免疫 CsA能抑制CYP-D表達(dá)或活性，從而減少MPTP開放，減輕組織損傷，認(rèn)為Cyp-D是引起細(xì)胞損傷的關(guān)鍵性蛋白。

(5)典型的大鼠IRI模型中術(shù)后一周腎功能恢復(fù)正常，腎小管上皮細(xì)胞完全恢復(fù)則需要4周或更長時間，此時與腎損傷相關(guān)的細(xì)胞因子也回到基線水平，

劉長濤等[11]認(rèn)為缺血損傷后面神經(jīng)元內(nèi)Cyp-D水平逐漸升高，7d達(dá)到最高，后逐漸降低，21d基本達(dá)到正常組織水平，這與我們的實驗結(jié)果存在出入，術(shù)后28dCyp-D仍有表達(dá)，且較24h有不同程度增加，可以推測其可能參與了細(xì)胞凋亡過程，這有待進(jìn)一步實驗研究。

Caspase家族是存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡最重要的蛋白酶，其中Caspase-3是主要的凋亡效應(yīng)蛋白，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，Caspase-3一旦活化，凋亡必然發(fā)生[9]。

本實驗中，無論再灌注早期及遠(yuǎn)期均可發(fā)現(xiàn)，隨缺血時間延長，Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)均有不同程度升高，且其表達(dá)與Cyp-D表達(dá)同步。當(dāng)缺血或缺氧時，CYP-D過度表達(dá)促進(jìn)MPTP開放，線粒體腫脹破裂，釋放膜間隙的促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C、AIF等，激活下游的caspase家族，從而產(chǎn)生一系列凋亡級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，此即經(jīng)典的經(jīng)線粒體凋亡途徑，結(jié)合既往的實驗研究[10,22]，本實驗將Caspase-3的表達(dá)作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，由此推測Cyp-D介導(dǎo)的線粒體功能障礙除早期引起細(xì)胞損傷外，并促進(jìn)遠(yuǎn)期細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究表明細(xì)胞凋亡可引起遠(yuǎn)期腎小管間質(zhì)纖維化，且與Casepase過度表達(dá)較大關(guān)系[23,24]。

傳統(tǒng)理念一直把30min作為常溫下腎臟缺血損傷的極限時間，認(rèn)為一旦超過此極限時間，將導(dǎo)致腎臟功能及病理形態(tài)學(xué)發(fā)生不可逆性損傷[25,26]，但部分動物實驗和臨床研究卻認(rèn)為腎臟安全的熱缺血時間可以超過30min，甚至選擇性腎動脈阻斷60或90min腎功能無明顯升高[27-29]，所以對IRI作用機(jī)制的研究并探討安全的熱缺血時間仍是泌尿外科及器官移植鄰域的研究熱點。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，缺血、缺氧導(dǎo)致能量代謝障礙并由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要原因，而CyP-D是構(gòu)成 MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子，是反應(yīng)線粒體結(jié)構(gòu)及功能障礙的指標(biāo)。根據(jù)病理檢查、Cyp-D及Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)研究結(jié)果得出小于30 min為腎臟熱缺血的安全時間，這與胡紅林等[30]在小鼠腎缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)30 min后血清肌酐、尿素和腎病理組織學(xué)評分均升高，35-45 min腎缺血時間熱缺血是制備腎缺血再灌注損傷模型較為理想的時間的結(jié)果是一致的。同樣Porpiglia等[31]、 Funahashi等[32]、徐輝照[33]研究腹腔鏡部分腎切除術(shù)術(shù)后患者腎功能變化，發(fā)現(xiàn)熱缺血時間超過30min近期及遠(yuǎn)期均能造成腎功能損害，術(shù)后一年僅部分功能恢復(fù)。

綜上所述，通過研究Cyp-D介導(dǎo)的線粒體功能障礙在大鼠腎缺血再灌注損傷中作用的發(fā)現(xiàn)，Cyp-D作為損傷蛋白能早期較好的反應(yīng)缺血再灌注損傷的程度，明確腎熱缺血再灌注時間，為臨床阻斷腎臟血流及器官移植提供可靠的實驗依據(jù)，同時其過度表達(dá)誘導(dǎo)MPTP不可逆開放，可作為缺血再灌注損傷的作用靶點，對防止腎缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。