高 路，姚 瑞，李亞彭，梁 翠，肖莉麗，張彥周

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

心血管病現(xiàn)患人數(shù)3.30億，其中冠心病1 100萬，心力衰竭890萬[1]。隨著心肌梗死患者接受血管再通治療的比例增多，心肌梗死后存活患者比例增高，這部分患者最終會發(fā)展成為心力衰竭[2]。心肌梗死中缺氧導致血管內(nèi)皮細胞損傷是心肌梗死后心力衰竭病理發(fā)展的主要原因[3]。在缺氧刺激下，內(nèi)皮細胞發(fā)生炎癥、氧化應激和凋亡，導致內(nèi)皮細胞增殖減少、舒張功能障礙、細胞數(shù)量減少[4]。此外，內(nèi)皮細胞自噬流受阻是缺氧誘導內(nèi)皮細胞損傷的主要病理改變[5]。因此，明確缺氧條件下內(nèi)皮細胞損傷的機制，對發(fā)現(xiàn)防治心臟缺血損傷新的干預靶點至關(guān)重要。

溶酶體組織蛋白酶B(CTSB)是一種溶酶體酶，其在維持溶酶體功能、細胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明CTSB在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。Mehra等[7]報道CTSB在擴張型心肌病患者血漿中表達增高與射血分數(shù)降低密切相關(guān)。CTSB可通過激活炎癥小體和促進細胞凋亡而加劇柯薩奇病毒B3誘導的心肌炎[8]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，CTSB基因敲除小鼠可通過TNF-α-ASK1-JNK途徑減輕壓力負荷下的心肌重構(gòu)[9]。但是CTSB是否可以通過調(diào)控自噬參與缺氧誘導的內(nèi)皮細胞損傷尚不清楚。本研究擬通過分離培養(yǎng)CTSB基因敲除小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，探討CTSB在缺氧誘導的內(nèi)皮細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料CTSB基因敲除(KO)小鼠購買于Jackson Lab(貨號: 030971，美國)；C57BL6J野生型(WT)小鼠購買于北京華富康公司；TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA試劑盒購買于Biolegend公司(貨號：430901, 432604, 431304美國)；CD31(貨號：ab28364)、鈣粘蛋白(Cadherin，貨號：ab33168)一抗購買于Abcam公司(美國)；LC3-GFP-mCherry雙標腺病毒購買于山東維真公司；Tunel染色試劑盒購買于Millipore公司(貨號：S7111，美國)；巴弗洛霉素(BAF，貨號：19-148)購買于Sigma公司；caspase-3活性檢測試劑盒購買于碧云天公司(上海，貨號：C1115)；CTSB過表達腺病毒購買于山東維真公司。

1.2 方法

1.2.1內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng) 4～6周C57BL6J小鼠或CTSB基因敲除小鼠心臟剪出后置于D-Hanks平衡液中沖洗，心臟剪碎后采用膠原酶在37 ℃消化心臟15 min，分5次消化后收集消化液，置于終濃度為10%FBS的DMEM-F12中，將細胞過濾后重懸，采用CD31磁珠吸附內(nèi)皮細胞，將內(nèi)皮細胞置于含10%FBS的DMEM-F12中培養(yǎng)。

1.2.2內(nèi)皮細胞分組處理

1.2.2.1 第一部分 實驗分組：① WT-常氧組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用常氧(5%CO2，95%空氣)培養(yǎng)48 h；② KO-常氧組：分離CTSB基因敲除小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用常氧處理48 h。③ WT-缺氧組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用缺氧(5%氧氣，95%N2)培養(yǎng)48 h；④ KO-缺氧組：分離CTSB基因敲除小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用缺氧處理48 h。

1.2.2.2 第二部分 將細胞分組：① Ad-NC-常氧組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用腺病毒空載體感染內(nèi)皮細胞8 h，采用常氧培養(yǎng)48 h；② Ad-CTSB-常氧組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用腺病毒感染內(nèi)皮細胞過表達CTSB(Ad-CTSB)8 h，采用常氧處理48 h。

③ Ad-NC-缺氧組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用腺病毒空載體感染內(nèi)皮細胞8 h，采用缺氧刺激48 h；④ Ad-CTSB-缺氧組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用腺病毒感染內(nèi)皮細胞過表達CTSB(Ad-CTSB)8 h，缺氧處理48 h；⑤ Ad-NC-常氧+巴弗洛霉素組(BAF)組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用腺病毒空載體感染內(nèi)皮細胞8 h，BAF (100 nmol·L-1)處理12 h，常氧處理48 h；⑥ Ad-CTSB-缺氧+BAF組：分離C57BL6J野生型小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用腺病毒感染內(nèi)皮細胞過表達CTSB 8 h，BAF(100 nmol·L-1)處理12 h，缺氧處理48 h。

1.2.3內(nèi)皮細胞CD31和鈣黏連蛋白免疫熒光染色 采用CD31和鈣黏連蛋白免疫熒光染色鑒定分離的心臟微血管內(nèi)皮細胞。細胞采用4%多聚甲醛固定5 min，采用0.1%TritonX通透后，采用8%羊血清封閉，采用抗CD31抗體和抗鈣黏連蛋白抗體(1 ∶100稀釋)4 ℃孵育過夜，采用Alexa FluorH 488羊抗小鼠和568羊抗兔二抗孵育1 h，采用DAPI進行細胞核染色，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4ELISA檢測炎癥細胞因子的釋放 各組處理完畢后收集細胞，將細胞在含有RIPA的裂解液中裂解后在冰上放置10 min，根據(jù)Elisa試劑盒配置標準蛋白，將樣本和標準品加入酶標板中，在37 ℃孵育30 min，洗滌后加入100 μL酶結(jié)合物，洗滌后加入1μLTMD，15 min后加入硫酸終止液，在酶標儀(Synergy HT, BioTek, 美國)450 nm處讀取吸光度。根據(jù)標準品濃度制作標準曲線，計算各樣本的濃度。

1.2.5TUNEL染色檢測細胞凋亡 細胞采用4%多聚甲醛固定5 min，采用0.1%TritonX通透后，采用Tunel試劑酶在37 ℃孵育1 h，采用DAPI進行細胞核染色，熒光顯微鏡(OLYMPUS BX43，日本)下觀察。細胞凋亡數(shù)量計算單個視野內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)*100%/總細胞數(shù)。

1.2.6caspase-3活性檢測 使用RIPA裂解液裂解細胞，加入檢測緩沖液，再加待測樣品，隨后再加入10 μL Ac-DEVD-pNA(2mM)，37 ℃孵育60 min。在酶標儀(Synergy HT，BioTek，美國)下檢測405 nm處吸光度。

1.2.7LC3-GFP-mcherry雙標病毒檢測細胞自噬流 細胞接種于24孔板，在處理前感染LC3-GFP-mcherry雙標病毒8 h，隨后進行各組處理，將細胞爬片取出，在熒光顯微鏡OLYMPUS BX43，日本)下計數(shù)細胞內(nèi)紅色和綠色LC3數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 CD31和鈣黏連蛋白染色鑒定內(nèi)皮細胞采用CD31和鈣黏連蛋白免疫熒光雙染色鑒定分離培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，結(jié)果顯示分離出的細胞均表達CD31和鈣黏連蛋白(Fig 1A)，提示心臟微血管內(nèi)皮細胞分離成功。采用免疫印跡鑒定內(nèi)皮細胞CTSB蛋白的表達，結(jié)果顯示，KO組小鼠內(nèi)皮細胞CTSB完全不表達，WT組內(nèi)皮細胞正常表達CTSB蛋白(Fig 1B)。

2.2 CTSB敲除加重缺氧誘導的內(nèi)皮細胞炎癥采用Elisa檢測野生型小鼠內(nèi)皮細胞和CTSB基因敲除內(nèi)皮細胞缺氧刺激后TNF-α、IL-1和IL-6的釋放，結(jié)果顯示：與WT-常氧組相比，WT-缺氧組內(nèi)皮細胞TNF-α、IL-1和IL-6的釋放明顯增加(P<0.05)；而KO-缺氧組內(nèi)皮細胞TNF-α、IL-1和IL-6的釋放高于缺氧組(P<0.05)，KO-常氧組與WT-常氧組之間上述炎癥因子的釋放無差異(P>0.05)。見Tab 1。

2.3 CTSB敲除加重缺氧誘導的內(nèi)皮細胞凋亡采用TUNEL染色檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示：與WT-常氧組相比，WT-缺氧組內(nèi)皮細胞凋亡細胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)；而KO-缺氧組內(nèi)皮細胞凋亡細胞數(shù)量明顯高于缺氧組(P<0.05)；KO-常氧組與WT-常氧組細胞凋亡數(shù)量無差異(P>0.05),見Fig 2，Tab 2。

Fig 1 Identification of endothelial cells(×200)

Tab 1 Release of inflammatory factors in endothelial cells in each group (n=6)

Fig 2 Endothelial cell apoptosis aggravated by CTSB knockout (×200)

Tab 2 Endothelial cell apoptosis aggravated by CTSB knockout (n=6)

Fig 3 Autophagy flow in endothelial cells blocked by CTSB knockout (×400) Legend: Green represents GFP, and red represents mCherry

采用caspase-3活性檢測試劑盒檢測細胞凋亡執(zhí)行器caspase-3的活性，結(jié)果顯示：與WT-常氧組相比，WT-缺氧組內(nèi)皮細胞caspase-3活性明顯增加(P<0.05)；而KO-缺氧組內(nèi)皮細胞caspase-3活性明顯高于缺氧組(P<0.05)；KO-常氧組與WT-常氧組caspase-3活性無差異(P>0.05),見Tab 2。

2.4 CTSB敲除阻斷內(nèi)皮細胞自噬流采用LC3-GFP-mCherry雙標腺病毒檢測內(nèi)皮細胞自噬流，結(jié)果顯示：與WT-常氧組比，WT-缺氧組LC3-GFP(綠色熒光點)數(shù)量明顯增多(P<0.05)；而KO-缺氧組內(nèi)皮細胞LC3-GFP數(shù)量多于WT-缺氧組(P<0.05)。KO常氧組LC3-GFP數(shù)量與WT-常氧組無差異(P>0.05)(Fig 3，Tab 2)。4組LC3-mCherry(紅色熒光)數(shù)量無差異(P>0.05)，提示CTSB基因敲除導致自噬降解受阻。

2.5 內(nèi)皮細胞腺病毒載體過表達CTSB第二部分實驗，采用腺病毒載體感染C57BL6J野生型小鼠來源的心臟微血管內(nèi)皮細胞，免疫印跡結(jié)果顯示：當采用MOI=50時，Ad-CTSB感染效率最佳(Fig 4)。

2.6 CTSB過表達減輕缺氧誘導的內(nèi)皮細胞炎癥采用ELISA檢測各組細胞TNF-α、IL-1和IL-6的釋放，結(jié)果顯示：與Ad-NC-常氧組相比，Ad-NC-缺氧組內(nèi)皮細胞TNF-α、IL-1和IL-6的釋放明顯增加(P<0.05)；而Ad-CTSB-缺氧組內(nèi)皮細胞TNF-α、IL-1和IL-6的釋放低于缺氧組(P<0.05)；Ad-NC-常氧+BAF組細胞炎癥因子的釋放高于Ad-NC-常氧組(P<0.05)；Ad-CTSB-缺氧+BAF組高于Ad-CTSB-缺氧組(P<0.05)，見Tab 3。

Tab 3 Release of inflammatory factors in endothelial cells in each group (n=6)

Fig 4 Endothelial cell adenovirus vector overexpression CTSB (n=6)

2.7 CTSB過表達減輕缺氧誘導的內(nèi)皮細胞凋亡采用Tunel檢測細胞凋亡水平，結(jié)果顯示：與Ad-NC-常氧組相比，Ad-NC-缺氧組內(nèi)皮細胞凋亡細胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)；而Ad-CTSB-缺氧組內(nèi)皮細胞凋亡低于缺氧組(P<0.05)。Ad-NC-常氧+BAF組細胞細胞凋亡數(shù)量高于Ad-NC-常氧組(P<0.05)；Ad-CTSB-缺氧+BAF組細胞凋亡數(shù)量高于Ad-CTSB-缺氧組(P<0.05)，見Fig 5，Tab 4。

2.8 CTSB過表達改善內(nèi)皮細胞自噬流采用LC3-GFP-mCherry雙標腺病毒檢測內(nèi)皮細胞自噬流，結(jié)果顯示：與Ad-NC-常氧組相比，Ad-NC-缺氧組LC3-GFP數(shù)量明顯增多(P<0.05)；而Ad-CTSB-缺氧組內(nèi)皮細胞LC3-GFP數(shù)量低于缺氧組(P<0.05)。Ad-NC-常氧+BAF組LC3-GFP數(shù)量高于Ad-NC-常氧組(P<0.05)；Ad-CTSB-缺氧+BAF組LC3-GFP數(shù)量高于Ad-CTSB-缺氧組(P<0.05)(Fig 6，Tab 4)。LC3-mCherry數(shù)量在6組之間無顯著性差異(P>0.05)。

Tab 4 CTSB overexpression reduces hypoxia-induced endothelial cell apoptosis and improves autophagy (n=6)

3 討論

內(nèi)皮細胞排列在心血管系統(tǒng)的血管內(nèi)，在維持心臟所需的氧氣和營養(yǎng)供應方面起著重要作用[10]。正常生理條件下，成人內(nèi)皮細胞在血管內(nèi)保持靜止，但是當受到外界刺激損傷時可迅速激活[11]。在缺氧條件下，過度的內(nèi)皮細胞損傷可導致其本身舒張功能障礙，增殖減少，小管形成功能降低，內(nèi)皮細胞凋亡增多。在心臟持續(xù)缺氧條件下，上述病理改變可導致心臟組織微血管數(shù)量減少，心肌細胞供氧減少，導致心肌細胞功能障礙和死亡，從而誘導心衰的發(fā)生發(fā)展[12]。因此，維持正常的心臟微血管內(nèi)皮細胞功能對保護病理條件下心臟功能至關(guān)重要。我們的研究發(fā)現(xiàn)CTSB可參與缺氧條件下內(nèi)皮細胞的損傷發(fā)生，在內(nèi)皮細胞中缺失CTSB，可加重缺氧條件下內(nèi)皮細胞的炎癥和凋亡；然而在內(nèi)皮細胞中過表達CTSB可減輕缺氧條件下內(nèi)皮細胞的炎癥和凋亡。細胞自噬在內(nèi)皮細胞病理損傷中發(fā)揮重要作用。細胞自噬是一個保守的過程，它是細胞器和長壽蛋白通過囊泡和溶酶體系統(tǒng)降解的主要途徑。自噬水平的改變對細胞而言可能是保護性的，也可能是有害性的，這取決于自噬的程度和細胞環(huán)境[13-14]。Martello等[15]報道，內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)水平自噬降低可導致內(nèi)皮細胞功能受損，心臟微血管密度降低。而Tang等[16]報道，通過減少自噬/線粒體自噬可保護內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷。目前對自噬在內(nèi)皮細胞中的作用報道不一。主要原因在于多數(shù)研究并未檢測細胞自噬流的水平。作為自噬溶酶體降解的主要酶之一，CTSB在自噬溶酶體降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。我們的研究采用CTSB全基因敲除小鼠，分離其心臟微血管內(nèi)皮細胞。采用LC3-GFP-mcherry自噬雙標病毒標記自噬流的動態(tài)。在未發(fā)生自噬的細胞及含有自噬體的細胞中，由于mCherry與GFP共同表達，細胞呈現(xiàn)黃色熒光。當自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環(huán)境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進而使自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光[18]。因此，綠色熒光越多，提示自噬降解受阻。我們發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，GFP綠色熒光明顯增多，而紅色熒光不變，提示內(nèi)皮細胞自噬降解明顯受阻。CTSB基因敲除內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，其綠色熒光明顯增加，紅色熒光與缺氧組無差異，提示CTSB基因敲除阻斷了內(nèi)皮細胞自噬溶酶體的降解，細胞自噬流受阻，凋亡增多。

Fig 5 Endothelial cell apoptosis induced by hypoxia reduced by CTSB overexpression (×200)

Fig 6 Endothelial cell autophagy flow improved by CTSB overexpression (×400)

巴弗洛霉素是V-ATPase酶抑制劑，可抑制細胞質(zhì)膜和溶酶體膜表面的V-ATPase酶，減少細胞質(zhì)內(nèi)H+離子向溶酶體轉(zhuǎn)運。巴弗洛霉素通過降低溶酶體的酸性環(huán)境減少自噬溶酶體的降解。本研究通過CTSB腺病毒載體感染內(nèi)皮細胞，增加內(nèi)皮細胞內(nèi)CTSB蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)細胞過表達CTSB能夠減輕缺氧誘導的炎癥和細胞凋亡。此外，CTSB蛋白過表達可增加自噬降解(表現(xiàn)為LC3-GFP綠色熒光明顯減少，而紅色熒光不變)。當采用巴弗洛霉素處理細胞后，CTSB蛋白過表達對內(nèi)皮細胞的保護作用不再發(fā)生(表現(xiàn)為細胞炎癥和凋亡明顯增高)。提示CTSB通過調(diào)控自噬溶酶體降解在內(nèi)皮缺氧損傷中發(fā)揮保護作用，CTSB保持自噬流的通暢是其保護內(nèi)皮細胞缺氧損傷的基礎(chǔ)。

以往的研究報道，CTSB在擴張型心肌病中表達增高，其與射血分數(shù)降低密切相關(guān)。CTSB可加劇柯薩奇病毒B3誘導的心肌炎[8]。CTSB基因敲除小鼠可減輕壓力負荷下的心肌重構(gòu)[9]。而這些研究均與我們的研究結(jié)果相悖。上述研究均在著重于CTSB在心肌細胞中的作用和機制，然而作為溶酶體蛋白之一，CTSB廣泛表達于除心肌細胞以外的其他細胞，如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞等。其在不同的細胞中可能發(fā)揮不同作用。另外一種可能是CTSB單獨缺失，內(nèi)皮細胞可能通過其他補償機制平衡自噬和凋亡(我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨過表達或者敲除CTSB并不會影響內(nèi)皮細胞自噬和凋亡)，但是在合并缺氧的條件下，CTSB缺失誘發(fā)的自噬抑制能夠大大增加內(nèi)皮細胞死亡。

綜上所述，CTSB參與內(nèi)皮細胞缺氧損傷，CTSB通過增加自噬降解改善缺氧導致的內(nèi)皮細胞自噬流阻塞，以CTSB作為靶點的治療方法可能成為延緩心肌梗死后心力衰竭的新手段。