肖振平，龍 慧,2，鄒 聰，蔣李平，何云武

(南華大學(xué)1. 附屬第二醫(yī)院疼痛康復(fù)科，湖南 衡陽 421003；2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后的一種常見性繼發(fā)性并發(fā)癥。研究表明OP的臨床表現(xiàn)主要為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)性退化并最終誘發(fā)骨脆性增加、骨折，甚至導(dǎo)致患者死亡，嚴(yán)重的危害患者的生命健康[1]。因此，積極探尋有效藥物治療對(duì)于改善OP尤為關(guān)鍵。

甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是由甲狀旁腺分泌的一種多肽鏈激素分子，其能夠通過靶向骨骼肌、小腸以及腎臟等器官從而調(diào)節(jié)機(jī)體鈣、磷代謝平衡。以往文獻(xiàn)表明，PTH能夠增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性、促進(jìn)骨吸收、升高血鈣等[2]。另外，PTH也能夠通過促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化、增加機(jī)體骨形成，改善骨密度，從而改善骨骼肌功能[3]。但是目前有關(guān)PTH對(duì)OP的作用機(jī)制尚不完全清楚。以往研究顯示磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein kinase B，AKT)信號(hào)與SCI密切相關(guān)。與sham組大鼠相比，SCI組大鼠p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著降低，激活PI3K/Akt能夠改善SCI大鼠組織炎癥和細(xì)胞凋亡，緩解OP[4-5]。另外，在大鼠SCI模型中miR-146a表達(dá)顯著降低[6]，過表達(dá)miR-146a能夠通過TLR/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)大鼠SCI的修復(fù)并減少炎癥反應(yīng)[7]。以上研究表明通過激活PI3K/Akt或是促進(jìn)miR-146a表達(dá)能夠改善大鼠SCI后OP。但是有關(guān)PTH能否通過促進(jìn)miR-146a表達(dá)，從而激活PI3K/Akt信號(hào)改善大鼠SCI后OP尚不清楚。既往研究顯示心力衰竭大鼠左心腔內(nèi)注射miR-146a能夠通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)疾病的發(fā)生與發(fā)展[8]，表明miR-146a是PI3K/Akt信號(hào)調(diào)控的上游因子。本研究在大鼠模型上證實(shí)了PTH在改善脊髓損傷后OP的同時(shí)也上調(diào)了骨組織miR-146a、PI3K和Akt的表達(dá)水平。而miR-146a抑制劑的使用不僅拮抗PTH對(duì)OP的改善，也同時(shí)拮抗PTH對(duì)miR-146a、PI3K和Akt表達(dá)的上調(diào)作用。說明PTH是通過上調(diào)miR-146a表達(dá)進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)通路，即調(diào)控miR-146a/PI3K/Akt信號(hào)軸，從而改善大鼠OP的。我們的研究結(jié)果可為OP的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 ♂，6周齡，SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量(18-200)g，購自于南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)：SYXK(湘)2019-0025，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：202002003)。

1.1.2藥品與試劑 甲狀旁腺激素1-34(批號(hào)：S110819-04，純度≥97%，100 μg/支，上海吉爾生化有限公司)；血鈣檢測試劑盒(批號(hào)：201935，南京建成生物技術(shù)公司)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(批號(hào)：201934，南京建成生物技術(shù)公司)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(批號(hào)：C0105S，上海碧云天生物技術(shù))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq以及TRIzol Reagent(日本TAKARA公司)；Akt抗體(批號(hào)：ab8805，英國Abcam公司)；p-Akt抗體(批號(hào)：ab38449，英國Abcam公司)；PI3K抗體(批號(hào)：ab32536，英國Abcam公)；p-PI3K抗體(批號(hào)：ab76302，英國Abcam公司)；β-actin抗體(批號(hào)：AF5001，上海碧云天生物技術(shù))；羊抗兔IgG抗體(批號(hào)：A0239，上海碧云天生物技術(shù))；羊抗鼠IgG抗體(批號(hào)：A0192，上海碧云天生物技術(shù))；極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：P0018FS，上海碧云天生物技術(shù))。

1.1.3儀器 TWK-FST32型組織勻漿儀(武漢泰普拓公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本尼康(Nikon)公司)；FC型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；7170A型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；LUNAR- Prodigy型雙能X線骨密度測定儀(美國GE公司)；1658033型電泳儀(美國伯樂Bio-Rad公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物建模與分組 實(shí)驗(yàn)SD大鼠在25 ℃，相對(duì)濕度50%-70%的室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，期間自由因飲水、飲食。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(Sham)、脊髓損傷組(SCI)、脊髓損傷+甲狀旁腺激素組(SCI+PTH)、SCI+PTH+轉(zhuǎn)染miR-146a無關(guān)片段組(SCI+PTH+NC)以及SCI+PTH+轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑組(SCI+PTH+miR-146a inhibitor)，每組各10只。其中SCI、SCI+PTH、SCI+PTH+NC和SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠構(gòu)建脊髓損傷模型：大鼠腹腔麻醉，將其取仰臥位固定在大鼠板上，采用剃毛刀剔除大鼠背部手術(shù)部位毛發(fā)并對(duì)其進(jìn)行消毒。之后利用手術(shù)剪刀剪開大鼠背部皮膚使其暴露T9～T11節(jié)椎間板與棘突，將T10節(jié)椎板切除，并將大鼠脊髓向外緣擴(kuò)展大約2.5 mm直徑的圓形區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)于硬膜表層處放置與脊髓表層彎曲度相同的塑料隔片，之后使用砝碼(10 g)順沿玻璃導(dǎo)管垂直下落，打擊隔片以制造出大鼠脊髓損傷，Sham組大鼠僅剪開背部皮膚使其暴露T9-T11節(jié)椎間板與棘突，之后封閉手術(shù)切口并給予青霉素鈉皮下注射(2萬U·d-1)。在造模成功的基礎(chǔ)上大鼠每3 d一次尾靜脈注射給予60 μg·kg-1PTH(SCI+PTH組)、60 μg·kg-1PTH及20 pm miR-146a NC(SCI+PTH+NC組)或60 μg·kg-1PTH及20 pm miR-146a inhibitor(SCI+PTH+miR-146a inhibtor組)，連續(xù)8周。Sham組和SCI組大鼠同法給予等量的生理鹽水。

1.2.2各組大鼠行為學(xué)評(píng)分 依據(jù)BBB評(píng)分法[9]對(duì)各組大鼠進(jìn)行包括髖關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)以及軀干運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)情況進(jìn)行相關(guān)觀察，記錄手術(shù)后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、56 d大鼠行為運(yùn)動(dòng)評(píng)分，為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)通過4人獨(dú)立觀察并打分。BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：共21分，全癱即為0分，正常為21分。

1.2.3骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)檢測 各組大鼠處理8周后，進(jìn)行心臟采血并于4 ℃，3 000 r·min-1，離心10 min，取其上清，采用7170A型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行免疫比濁法測定血清鈣(calcium，Ca)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量。

1.2.4骨密度測定 實(shí)驗(yàn)各組大鼠處理8周后，采用LUNAR- Prodigy型雙能X線骨密度測定儀對(duì)大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度進(jìn)行測定，每組共計(jì)10只SD大鼠。實(shí)驗(yàn)操作由2人獨(dú)立完成，取其平均值即為實(shí)驗(yàn)大鼠骨密度值。

1.2.5HE染色 各組大鼠麻醉后，迅速采用斷頭處死，剪取8周大鼠脊髓損傷部位的脊髓組織，采用4%的多聚甲醛固定各組大鼠脊髓組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進(jìn)行脊髓組織染色，顯微鏡下觀察各組大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-146a表達(dá) 依據(jù)RNA提取試劑盒說明書步驟提取各組大鼠脊髓總RNA，并運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：92 ℃，30 s；92 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2-ΔΔCt值相對(duì)定量樣本中目的基因表達(dá)水平。

Tab 1 Sequence of primer

1.2.7Western blot檢測PI3K、Akt蛋白表達(dá) 取8周各組大鼠手術(shù)截取的脊髓損傷部位的脊髓組織，組織碾磨，裂解；BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)Akt抗體(1 ∶1 000)，p-Akt抗體(1 ∶1 000)，PI3K抗體(1 ∶1 000)，p-PI3K抗體)以及β-actin抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過夜，孵育對(duì)應(yīng)的羊抗兔IgG抗體或者羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000)1～2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)水平則以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

2 結(jié)果

2.1 PTH對(duì)大鼠BBB評(píng)分的影響手術(shù)后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、56 d大鼠BBB行為運(yùn)動(dòng)評(píng)分顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠BBB評(píng)分均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠BBB評(píng)分明顯降低(P<0.05或P<0.01)(Tab 2)。

2.2 PTH對(duì)大鼠血清Ca和ALP含量的影響手術(shù)后8周，與Sham組相比，SCI組大鼠血清Ca含量明顯降低(P<0.01)，ALP含量明顯升高(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠血清Ca含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，ALP含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠血清Ca含量降低(P<0.01)，ALP含量升高(P<0.01)(Fig 1)。

2.3 PTH對(duì)大鼠骨密度的影響手術(shù)后8周，與Sham組相比，SCI組大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度均明顯降低(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度均升高(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度均降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)

2.4 PTH對(duì)大鼠脊髓形態(tài)學(xué)的影響手術(shù)后8周，HE染色顯示，Sham組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)完整，骨質(zhì)密度粗壯，形態(tài)完整，連接緊密，骨細(xì)胞排列齊整，有大量的骨小梁存在。SCI組大鼠出現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松癥狀，表現(xiàn)為骨小梁減少、稀疏，骨細(xì)胞間隙增寬并伴有骨板層結(jié)構(gòu)疏松等，SCI+PTH和SCI+PTH+NC組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，骨質(zhì)密度變密，且骨小梁數(shù)目明顯高于SCI組，骨質(zhì)細(xì)胞連續(xù)性較好，細(xì)胞排列基本齊整。SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠表現(xiàn)為骨細(xì)胞間隙增寬等且出現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象(Fig 3)。

Tab 2 Comparison of BBB scores of rats in each

Fig 1 Comparison of serum Ca and ALP levels in rats of each n=10)

Fig 2 Effect of PTH on bone mineral density in n=10)

Fig 3 Observation of morphological changes of spinal cord of each group of rats by HE staining(400×)

2.5 PTH促進(jìn)miR-146a表達(dá)手術(shù)后8周，RT-PCR檢測顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠骨髓組織miR-146a表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織miR-146a表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠骨髓組織miR-146a表達(dá)下調(diào)(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 4 Expression level of miR-146ain each group of n=10)

2.6 PTH促進(jìn)p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)手術(shù)后8周，Western blot檢測顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均升高(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 5)。

3 討論

SCI是一種嚴(yán)重性致殘性傷害，可導(dǎo)致脊髓支配運(yùn)動(dòng)、感覺以及自主神經(jīng)功能障礙等多種并發(fā)癥的發(fā)生。因此，積極的治療SCI對(duì)于改善患者繼發(fā)性并發(fā)癥，減輕家庭負(fù)擔(dān)具有重要意義。目前有關(guān)SCI的臨床治療措施主要包括急性期保護(hù)措施、并發(fā)癥治療、康復(fù)治療、SCI修復(fù)治療如神經(jīng)因子、相關(guān)激素、組織干細(xì)胞移植治療等[10]。研究表明PTH作為SCI修復(fù)激素治療對(duì)于改善其臨床并發(fā)癥具有顯著療效[11]。另外，PTH在維持SCI后OP中具有雙重調(diào)節(jié)作用，一方面可以增加成骨細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)骨生長因子釋放，進(jìn)而促進(jìn)骨形成。另一方PTH能夠增加破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收[2]。血清Ca和ALP是骨代謝的關(guān)鍵性生化指標(biāo)，其中Ca參與機(jī)

Fig 5 Effect of PTH on PI3K/Akt signal

體內(nèi)礦物質(zhì)平衡以及骨骼肌生長發(fā)育等。ALP是與骨形成和骨細(xì)胞活性密切相關(guān)的生化指標(biāo)。通過檢測血清Ca和ALP含量能夠反映SCI后OP狀況。基于以上本研究首先通過構(gòu)建SCI大鼠模型探究PTH能夠改善SCI并發(fā)OP。結(jié)果顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠BBB評(píng)分均明顯降低，血清Ca降低、ALP升高，股骨近端以及脛骨近端的骨密度降低且脊髓組織出現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松癥狀，表現(xiàn)為骨小梁減少、稀疏，骨細(xì)胞間隙增寬并伴有骨板層結(jié)構(gòu)疏松，表明SCI大鼠模型構(gòu)建成功。而SCI+PTH組大鼠上述癥狀得到明顯改善。以上研究初步表明PTH對(duì)SCI后OP大鼠具有一定治療作用，但是有關(guān)PTH對(duì)SCI的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的小分子非編碼RNA，其在SCI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。既往研究證實(shí)，miRNA能夠靶向抑制目標(biāo)蛋白mRNA，抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，參與了機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化以及代謝等病理生理過程，特別是在SCI的進(jìn)展中起到至關(guān)重要的作用[13]。研究miR-146a是位于染色體5q24參與SCI骨髓細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。在SCI小鼠模型中通過基因芯片篩選顯示miR-146a表達(dá)明顯降低，其表達(dá)水平與SCI損傷程度呈負(fù)相關(guān)[14]。表明miR-146a可能是SCI病理過程中的重要調(diào)控因子。但是有關(guān)PTH能否通過影響miR-146a表達(dá)進(jìn)而改善SCI尚不清楚。因此，本研究通過RT-PCR檢測各組大鼠脊髓組織miR-146a水平。結(jié)果顯示與Sham組相比，SCI組miR-146a表達(dá)明顯下調(diào)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織miR-146a表達(dá)均明顯上調(diào)。以上研究結(jié)果表明PTH能夠通過促進(jìn)miR-146a表達(dá)，繼而改善SCI后OP。PI3K/Akt信號(hào)是與SCI骨髓細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥以及成骨等密切相關(guān)。以往文獻(xiàn)報(bào)道顯示激活PI3K/Akt能夠增加星形膠質(zhì)神經(jīng)營養(yǎng)因子和粘附分子釋放，增強(qiáng)體外傷口修修復(fù)，從而促進(jìn)SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[15]。另外，PTH通過PTH受體激活下游PI3K/Akt/Bad通路從而發(fā)揮抗成骨樣細(xì)胞凋亡作用[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測顯示與Sham組相比，SCI組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均明顯降低。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均顯著升高。本研究結(jié)果與Chen等[4]研究一致。表明PTH能夠通過促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)活化，改善大鼠SCI后OP。為進(jìn)一步明確miR-146a/PI3K/Akt信號(hào)在PTH治療SCI中的關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究通過SCI大鼠尾靜脈注射miR-146a inhibitor，觀察PTH是否通過上調(diào)miR-146a，從而激活PI3K/Akt信號(hào)，并最終改善SCI后OP。結(jié)果顯示與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均顯著降低，BBB評(píng)分明顯降低、血清Ca含量降低，ALP含量升高、股骨近端以及脛骨近端的骨密度均降低且伴有典型的骨質(zhì)疏松癥狀。以上研究結(jié)果表明PTH能夠通過miR-146a/PI3K/Akt信號(hào)改善SCI后大鼠OP。既往研究顯示miR-146a能夠通過PI3K/Akt信號(hào)調(diào)控腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等增殖、遷移等[17-18]。因此，在PTH改善SCI大鼠OP時(shí)miR-146a可能是PI3K/Akt的關(guān)鍵上游調(diào)控因子。

綜上所述，本研究通過探究PTH對(duì)SCI后大鼠OP的影響及其作用機(jī)制。結(jié)果顯示PTH對(duì)SCI骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用，其機(jī)制可能通過調(diào)控miR-146a/PI3K/Akt信號(hào)實(shí)現(xiàn)。