石振金，張瑞林，王一航，吳亞梅，楊根夢，沈寶玉，王 上，劉鵬亮， 朱婷娜，趙永娜，李利華，張冬先，洪仕君

(1.昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.楚雄醫(yī)藥高等?？茖W校，云南 楚雄 675005； 3.昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)是一種安非他明類中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，MA濫用者在我國240.4萬名在冊吸毒人員中占比56.1%[1]，是濫用人數(shù)最多的毒品類型。MA具有極強的依賴性，會引起認知障礙、焦慮、抑郁以及暴力行為等精神系統(tǒng)障礙癥狀，甚至中毒導致因腦出血、缺血缺氧而昏迷或死亡。迄今為止MA的依賴機制尚未明確。微RNA(micro RNA，miRNA)是腦內(nèi)廣泛存在的基因轉錄調控因子，調節(jié)神經(jīng)元凋亡和突觸相關基因表達。既往研究表明，miRNA-132在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異常表達可能與MA誘發(fā)的神經(jīng)毒性作用密切相關。在miRNA-132基因上游調控序列中存在轉錄激活因子環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)結合位點，而與中樞神經(jīng)發(fā)育相關的甲基化CpG結合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，Mecp2)則為miRNA-132的直接作用靶點之一。但miRNA-132、Mecp2在MA所致神經(jīng)毒性損害和依賴中的作用尚未見文獻報道。因此，本文試圖探討MA是否可通過CREB調控miRNA-132影響miRNA-132及Mecp2的表達，從而參與MA的依賴機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器甲基苯丙胺由云南省公安廳公安部禁毒技術重點實驗室合法提供，化學法提純后用生理鹽水配制成10 g·L-1的MA溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。Mecp2一抗(兔抗，1 ∶1 000，Cell Signaling公司，D4F3，#3456)，p-Mecp2一抗(兔抗，1 ∶1 000，Novus公司，pSer421，#NBP2-29524)，CREB一抗(兔抗，1 ∶1 000，Cell Signaling公司，D76D11，#9197)，p-CREB一抗(兔抗，1 ∶1 000，Cell Signaling公司，Ser133，#9198)，β-actin(鼠抗，1 ∶5 000，Proteintech 公司，66375-1-Ig，#2D4H5)。HRP標記山羊抗鼠的二抗(1 ∶5 000，Abbkine公司，A21010)，HRP標記山羊抗兔的二抗(1 ∶5 000，Abbkine公司，A21020)，mRNA逆轉錄試劑盒(BestarTMqPCR RT Kit，DBI Bioscience，DBI-2220)，qPCR檢測mRNA試劑盒(BestarR SybrGreen qPCR Mastermix，DBI Bioscience，DBI-2043)，miRNA逆轉錄試劑盒(All-in-oneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit，GeneCopoeia，QP014)，qPCR檢測miRNA試劑盒(All-in-oneTMmiRNA qPCR Kit，GeneCopoeia，QP011)。

主要儀器：條件性位置偏愛檢測設備(上海欣軟信息有限公司，型號XR-XT401)；電泳儀、膜轉印裝置(Bio-Rad公司)；PCR儀(Bio-Rad公司，型號T100TMThermal Cycler)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，型號C1000 TouchTMThermal Cycler)。

1.2 動物模型雄性SD大鼠60只，5～6周齡，體質量(180～220) g，購于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部[許可證號：SCXK(滇)2011-0004]，隨機分成6組，分別為MA依賴1周、2周、4周組及對照的生理鹽水組。腹腔注射MA(10 mg·kg-1·d-1)與生理鹽水(10 mg·kg-1·d-1)10 d后，用 條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)及刻板行為(stereotyped behavior，SB)評分確認大鼠產(chǎn)生MA依賴，再分別給藥1、2、4周建立不同依賴時程MA依賴模型，再用CPP實驗和SB評分檢測行為學改變。末次給藥24 h后，用10 g·L-1水合氯醛麻醉，灌注取腦，分離額葉皮質、海馬組織，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 Western blot檢測蛋白質表達腦組織解凍后稱取約200 mg，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解，BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液(5X)后混勻、變性。以50 ng上樣，SDS-PAGE電泳分離，半干轉膜儀轉至0.45 μm PVDF膜上；膜用5%脫脂奶粉(或5% BSA)于搖床上室溫封閉1 h，分別加入相應Mecp2一抗，p-Mecp2一抗，CREB一抗和p-CREB一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，再加入相應種屬二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h；ECL化學發(fā)光顯色，Bio-Rad凝膠成像儀顯影成像。ImageJ圖像軟件分析Western blot條帶灰度值，計算目的蛋白相對于內(nèi)參β-actin的相對含量，磷酸化目的蛋白相對于總蛋白的相對含量。

1.4 RT-qPCR檢測miRNA及mRNA

1.4.1RT-qPCR引物信息 經(jīng)NCBI網(wǎng)站查詢目的基因序列信息后，用Primer Premier 5軟件設計引物，由上海生工生物工程技術有限公司合成(Tab 1)。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4.2實驗步驟 腦組織解凍后稱取約100 mg，用TRIzol法提取總RNA，以2 μg 總RNA進行RT-qPCR反應。①用mRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，再用qPCR試劑盒檢測Mecp2 mRNA，以GAPDH為內(nèi)參基因。②用miRNA試劑盒合成第一鏈cDNA，再用qPCR試劑盒檢測miRNA-132，以U6為內(nèi)參基因。2-△△ct法比較各組mRNA和miRNA的表達差異。

2 結果

2.1 動物模型建立MA依賴1、2、4周組大鼠在伴藥箱的停留時間明顯增加，均產(chǎn)生明顯CPP效應。大鼠出現(xiàn)明顯的興奮性及刻板行為，刻板行為評分隨著依賴時間延長而減少。實驗結果參見課題組前期發(fā)表的數(shù)據(jù)[2]。

2.2 RT-qPCR檢測miRNA-132、Mecp2 mRNA表達miRNA-132在甲基苯丙胺依賴1、2周組(P<0.01)和4周組(P<0.05)額葉皮質中表達明顯升高；在海馬中表達呈降低趨勢，其中在MA依賴2、4周組明顯降低(P<0.01)(Fig 1A)。Mecp2 mRNA在MA依賴1、2、4周組額葉皮質(P<0.05或P<0.01)和海馬(P<0.01)中表達均升高(Fig 1B)。

2.3 額葉皮質中Mecp2、p-Mecp2、CREB、p-CREB表達Mecp2在MA依賴1、2、4周組(P<0.01)額葉皮質中表達明顯降低(Fig 2A，B)，且磷酸化水平呈升高趨勢，在MA依賴1、2周組(P<0.01)中磷酸化水平明顯升高(Fig 2A,C)。CREB在1、2、4周組額葉皮質中表達無明顯變化(Fig 2A,D)，但磷酸化水平呈降低趨勢，在1、4周組中磷酸化水平明顯降低(P<0.01)(Fig 2A,E)。

Fig 1 Expression of miRNA-132 and Mecp2 mRNA in frontal cortex and hippocampus of MA-induced

Fig 2 Expression of Mecp2, p-Mecp2/Mecp2, CREB and p-CREB/ CREB in frontal cortex of MA-induced

2.4 海馬中Mecp2、p-Mecp2、CREB、p-CREB表達Mecp2在MA依賴1周組(P<0.05)海馬中表達明顯升高，之后呈降低趨勢，在MA依賴4周組(P<0.05)中表達明顯降低(Fig 3A,B)。Mecp2的磷酸化水平在MA依賴1周組(P<0.01)表達明顯降低，之后呈升高趨勢，在MA依賴2周組(P<0.01)中明顯升高(Fig 3A,C)。CREB及其磷酸化在MA依賴1、2、4周組海馬中均無明顯表達變化(Fig 3 A,D-E)。

3 討論

本研究以腹腔注射MA建立1、2、4周不同時程的MA依賴大鼠模型，MA在各實驗組均導致大鼠表現(xiàn)出明顯的CPP效應。CPP實驗利用條件性刺激影響動物位置偏好，以產(chǎn)生藥物依賴動物的行為學特點評價藥物的依賴性，是評價動物出現(xiàn)藥物依賴的經(jīng)典動物模型。

Fig 3 Expressions of Mecp2, p-Mecp2/Mecp2, CREB and p-CREB/CREB in hippocampus of MA dependent n=3)

額葉皮質、海馬是調節(jié)行為活動、認知功能、學習和記憶的重要腦區(qū)，miRNA-132在MA依賴1、2、4周組額葉皮質中表達明顯升高，在海馬中則表達降低，雖然兩個腦區(qū)miRNA -132的表達趨勢不一致，但均存在明顯的異常表達。此前，有研究在體外培養(yǎng)miRNA-212/132敲除幼鼠皮質神經(jīng)元，神經(jīng)元有出現(xiàn)樹突短縮、分叉等改變[3]，靶向敲除miRNA-212/132基因會對海馬中mRNA的轉錄譜產(chǎn)生廣泛影響，并出現(xiàn)空間記憶、識別記憶和認知功能障礙[4]，miRNA-132表達減少會增加神經(jīng)退行性疾病的患病率。但Chen等[5]在神經(jīng)干細胞轉染miRNA-132后，也發(fā)現(xiàn)miRNA-132通過影響細胞周期，促進細胞凋亡來抑制神經(jīng)元的分化，且促進膠質細胞分化。維持miRNA-132穩(wěn)定在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調節(jié)具有重要作用，miR-132輕度表達增加可增強認知功能，但超生理水平的miR-132則會損害學習功能[6]。上述研究結果說明miRNA-132參與了調節(jié)MA依賴引起的神經(jīng)損害作用。

miRNA為小分子單鏈非編碼RNA，是基因轉錄后調控因子，由RNA聚合酶II編碼生成初級產(chǎn)物pre-miRNA，經(jīng)Dicer酶切后形成約20個核苷酸的雙鏈miRNA，其中一鏈與靶mRNA的3′非編碼區(qū)互補配對，一方面裝載成RISC沉默復合體降解mRNA，另一方面與翻譯起始區(qū)結合抑制mRNA翻譯[7]。在MA依賴者的血漿、外泌體以及組織中均發(fā)現(xiàn)包括miRNA-132在內(nèi)的miRNA的異常表達。miRNA-132位于人17號和大鼠10號染色體，與miRNA-212合稱為miRNA-212/132家族[8]。MA可增加第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)分泌，活化CREB后與miRNA-212/132基因上游CRE位點的結合，調節(jié)miRNA-212/132的生成[9]。CREB參與MA依賴機制已有多篇文獻報道，MA通過cAMP / PKA / CREB通路實現(xiàn)CREB的磷酸化激活，CREB活化后與c-fos、fosb、Syp、BDNF等基因的啟動子結合而發(fā)揮作用[10]，miRNA-132亦受CREB的調控。本研究中，CREB的表達在額葉皮質無明顯差異，MA在1周和4周組中抑制了CREB的磷酸化，而海馬中CREB及其磷酸化均無明顯差異。有報道認為MA可抑制伏隔核、海馬中CREB的磷酸化激活，但在不同依賴時程、不同腦區(qū)組織中CREB蛋白的磷酸化水平存在差異[11]，CREB磷酸化在MA依賴中可能無穩(wěn)定的表達變化趨勢，CREB磷酸化水平降低也未影響miRNA-132的表達。MA可能通過其他轉錄因子介導調節(jié)miRNA-132表達，如已報道的MSK1/2、ERK1/2途徑等[12]，有待深入探索。

Mecp2 mRNA為miRNA-132的作用靶點之一。Mecp2為甲基CpG結合域家族成員，可招募胞嘧啶甲基轉移酶、組蛋白去乙?；负推渌旧|重塑蛋白介導基因沉默[13]，而Chahrous等[14]檢測缺失或過表達Mecp2小鼠下丘腦內(nèi)基因表達時，發(fā)現(xiàn)大部分靶基因被Mecp2激活，其兼具轉錄激活因子和抑制因子作用。Mecp2基因缺陷為中樞系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病Ratt綜合征的主要病因，對神經(jīng)元成熟、突觸形成和突觸可塑性具有調節(jié)作用。在額葉皮質，MA依賴各組中Mecp2 mRNA表達均升高，而Mecp2蛋白表達降低，與miRNA-132對Mecp2 mRNA的轉錄后調控作用的理論相吻合，miRNA-132對Mecp2 mRNA有轉錄后抑制作用。但在海馬，MA依賴各組中miRNA-132表達降低，Mecp2 mRNA表達升高，Mecp2蛋白在MA依賴1周組時表達增加，此后隨MA依賴時間的延長而降低，在MA依賴4周組中Mecp2的表達降低尤為明顯，miRNA-132與Mecp2表達趨勢未呈現(xiàn)負對應關系。此前，Aten等[15]在晝夜節(jié)律研究中也發(fā)現(xiàn),miRNA-132在海馬表達變化會影響神經(jīng)元形態(tài)和記憶功能，但Mecp2與miRNA-132表達趨勢一致，認為在蛋白表達/調控水平上，中樞內(nèi)的動力學改變也會影響miRNA的功能效果，mRNA穩(wěn)定性和翻譯速率以及蛋白質的半衰期，均影響著miRNA的作用效應。Morozova等[16]也提出miRNA的作用模式還取決與靶mRNA的自身特征，因此，存在多個靶點時，并非所有靶點表達均受影響。Im等[17]則提出miRNA-212/132和Mecop2之間的作用穩(wěn)態(tài)可調節(jié)可卡因的攝取，觀察到連續(xù)注射7 d可卡因后Mecp2在紋狀體和海馬中高表達，在額葉皮質中則表達降低，海馬中Mecp2的表達與本研究MA依賴1周組的結果相似。Deng等[18]的研究也表明，Mecp2參與慢性MA依賴中興奮性和抑制性信號傳遞，慢性MA作用會增加Mecp2磷酸化而調節(jié)中樞內(nèi)蛋白的轉錄活動，與之相似的是，本研究中MA依賴中Mecp2磷酸化水平也有明顯增加。上述結果均說明，Mecp2在MA依賴所致的毒性損害中有調節(jié)作用，但額葉皮質和海馬兩個腦區(qū)中Mecp2的作用模式存在差異。

綜上，MA依賴可誘導額葉皮質和海馬腦區(qū)中miRNA-132的異常表達。在額葉皮質，miRNA-132可能通過抑制Mecp2 mRNA的翻譯，致Mecp2蛋白表達降低；但在海馬，miRNA-132 與Mecp2表達趨勢未呈現(xiàn)負對應關系。研究結果提示miRNA-132與Mecp2參與了調節(jié)MA誘導的神經(jīng)毒性損害，miRNA-132在額葉皮質中的作用可能是通過Mecp2發(fā)揮的，但在海馬中并不依賴于Mecp2發(fā)揮其作用，Mecp2在額葉皮質和海馬中的作用模式和機制存在差異。