侯成立，黃彩燕，鄭曉春，劉維華，楊奇?，張德權(quán)?

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，銀川 750011

0 引言

【研究意義】羊肉是三大畜肉之一，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)食品，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可提供人體必需的氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等。鹽池灘羊是我國(guó)優(yōu)良特色畜種、中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品，鹽池灘羊肉肉質(zhì)細(xì)嫩、無膻味、脂肪分布均勻、風(fēng)味獨(dú)特，深受廣大消費(fèi)者喜愛，是我國(guó)高端羊肉的代表品牌。近年來，隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者越來越多地關(guān)注肉品的新鮮度、安全性和功能性，對(duì)高品質(zhì)健康肉的需求越來越大[1-2]。肉的抗氧化能力與肉品質(zhì)密切相關(guān)，研究宰后不同時(shí)間羊肉抗氧化活性變化對(duì)生鮮羊肉的品質(zhì)調(diào)控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】動(dòng)物宰后會(huì)經(jīng)歷僵直、解僵成熟、腐敗3個(gè)過程，宰后不同貯藏時(shí)間對(duì)羊肉品質(zhì)有重要影響[3]。僵直前羊肉保水性高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失少，加工特性優(yōu)于解僵后的羊肉[4-5]；僵直前和解僵初期煮制的羊肉風(fēng)味物質(zhì)含量豐富，而解僵后烤制的羊肉風(fēng)味物質(zhì)含量相對(duì)豐富[6]。關(guān)于宰后僵直和解僵成熟過程對(duì)肉品質(zhì)的影響在國(guó)內(nèi)外已開展了大量研究，而對(duì)僵直前生鮮肉的品質(zhì)研究則較少，從而成為近年來的熱點(diǎn)。動(dòng)物屠宰后，肌肉內(nèi)仍進(jìn)行著各種氧化反應(yīng)，并且氧化反應(yīng)的程度與肉品質(zhì)密切相關(guān)[7-8]。研究表明，生鮮肉加工與貯藏過程中，蛋白質(zhì)的氧化是導(dǎo)致肉品品質(zhì)下降的主要原因，如蛋白質(zhì)氧化能夠抑制μ-鈣蛋白酶的活性從而影響生鮮肉嫩度[9]。宰后肌肉的抗氧化活性與飼養(yǎng)過程中的飼料組成、動(dòng)物品種、年齡、分割部位、貯藏時(shí)間等外部因素有關(guān)，同時(shí)生鮮肉的抗氧化活性與游離氨基酸的組成與含量密切相關(guān)[10-15]。【本研究切入點(diǎn)】現(xiàn)有研究更多地關(guān)注解僵成熟生鮮肉在貯藏過程中的氧化反應(yīng)變化，關(guān)于宰后早期羊肉抗氧化活性的變化未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)以灘羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在宰后0.5、3、6、12和48 h取背最長(zhǎng)肌，探究宰后不同時(shí)間灘羊肉抗氧化活性的變化，并從游離氨基酸、蛋白質(zhì)組角度闡釋抗氧化活性變化的原因，為開發(fā)高品質(zhì)羊肉提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

樣品采集試驗(yàn)于2018年12月在寧夏鹽池灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司進(jìn)行；樣品測(cè)定試驗(yàn)于 2019—2020年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所肉品實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品采集 選取同一養(yǎng)殖場(chǎng)的 6月齡健康舍飼未去勢(shì)公灘羊6只，飼喂大北農(nóng)集團(tuán)肉羊育肥期配合飼料。按伊斯蘭屠宰方式屠宰，胴體重為（18.30±1.41）kg，宰后立即推入0—4℃冷卻間冷卻，分別在宰后0.5、3、6、12和48 h取單側(cè)背最長(zhǎng)肌的部分肌肉樣品（約100 g），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別各選擇3只灘羊取左側(cè)背最長(zhǎng)肌、3只灘羊取右側(cè)背最長(zhǎng)肌樣品，剔除表面脂肪和筋膜，將肌肉樣品分為兩份，一份 5 g左右，經(jīng)液氮冷凍后干冰保存，冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-80℃貯存，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析；剩余95 g左右樣品，經(jīng)液氮冷凍后，用干冰保存，并用冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-20℃貯存?zhèn)溆?，用于游離氨基酸、抗氧化性能測(cè)定。

1.1.2 主要儀器與試劑 LGJ-25冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；超低溫冰箱，美國(guó) Thermo公司；ML204/02電子天平，上海梅特勒-托利多有限公司；FCR1000-UF-E超純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司；SpectraMax 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司；HITACHI高速冷凍離心機(jī)，日立（中國(guó)）有限公司；TissueLyser LT研磨儀，德國(guó)QIAGEN公司；SorvallTMLegendTMMicro 17微量離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；Ultra Turrax Disperser S25勻漿儀，德國(guó)IKA集團(tuán)；SC210A真空干燥儀，美國(guó) Thermo公司；RIGOL L-3000高效液相色譜，北京普源精電科技有限公司；Orbitrap Q-Exactive HF質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo公司。

氧自由基吸收能力（oxygen-radical absorbance capacity，ORAC）抗氧化試劑盒（AOX-2），Zenbio公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(2, 2-聯(lián)氮基雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2, 2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)，ABTS快速法），上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化活性的測(cè)定 采用 QUENCHER方法對(duì)抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.2.1.1 樣品制備 參考OH等[16]方法制備樣品，稱取10 g灘羊背最長(zhǎng)肌樣品，切碎，采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干（冷阱溫度-60℃，物料溫度-40℃，真空度1 Pa），凍干時(shí)間為27 h；將凍干后的樣品采用研缽研磨，并與纖維素以1∶1（w/w）的比例混合，稀釋后采用50目篩過篩，用于抗氧化能力的測(cè)定。

1.2.1.2 鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定 參考BENZIE 和 STRAIN[17]的方法，分別配制 300 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 3.6）、10 mmol·L-12,4,6-三吡啶-咪嗪（TPTZ）溶液與40 mmol·L-1鹽酸的混合液、20 mmol·L-1氯化鐵溶液，并以 10∶1∶1（v/v/v）的比例混合制備FRAP工作液，在37℃孵育30 min后使用。將10 mg肉粉-纖維素（1∶1）樣品轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入10 mL FRAP工作液開始反應(yīng)，避光渦旋30 s使試管充分混合，于室溫避光條件下在軌道搖床上以200 r/min的速度搖晃混合物，以促進(jìn)樣品顆粒和FRAP溶液之間的充分反應(yīng)，將自由基溶液引入肉樣品120 min后，699×g離心2 min，取200 μL上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，并在595 nm處測(cè)量吸光度值。FRAP活性表示為每千克干重肉的Trolox毫摩爾當(dāng)量（mmol Trolox Eq./kg干肉）。

1.2.1.3 ABTS自由基清除能力測(cè)定 采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒操作說明進(jìn)行前處理，稱取10 mg肉粉-纖維素（1∶1）樣品轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入10 mL冰冷的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行勻漿，4℃下12 000×g離心5 min，取上清液用于后續(xù)測(cè)定。取20 μL過氧化物酶工作液加入到96孔板中，加入10 μL待測(cè)樣品上清液后，加入170 μL ABTS工作液，輕輕混勻，室溫孵育6 min，并在414 nm處測(cè)定吸光度值。ABTS自由基清除能力表示為每千克干重肉的 Trolox毫摩爾當(dāng)量（mmol Trolox Eq./kg干肉）。

1.2.1.4 2,2-二苯代苦味?；诫拢?,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定 參考OH等[16]方法進(jìn)行測(cè)定，稱取40 mg DPPH溶解于100 mL乙醇中制備DPPH儲(chǔ)備溶液A，然后用100 mL去離子水稀釋DPPH儲(chǔ)備溶液A，獲得水-乙醇（50∶50，v/v）混合物的DPPH儲(chǔ)備溶液B，將200 mL儲(chǔ)備溶液A與800 mL儲(chǔ)備溶液B混合得到DPPH工作溶液。稱取10 mg肉粉-纖維素（1∶1）樣品轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中，添加10 mL的DPPH工作溶液開始反應(yīng)，在黑暗中渦旋30 s使試管充分混合，于室溫避光條件下在軌道搖床上以 200 r/min的速度搖晃混合物，以促進(jìn)肉樣品顆粒和DPPH溶液之間的反應(yīng)，將自由基溶液引入肉樣品30 min后，699×g離心2 min。取200 μL上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，并在540 nm處測(cè)量吸光度值。DPPH自由基清除能力表示為每千克干重肉的 Trolox毫摩爾當(dāng)量（mmol Trolox Eq./kg干肉）。

1.2.1.5 氧自由基吸收能力（ORAC）測(cè)定 采用ORAC熒光法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，將10 mg肉粉-纖維素（1∶1）樣品加入到15 mL離心管中，添加10 mL冰冷的工作液，避光渦旋30 s使其充分混合待用；按照試劑盒操作說明進(jìn)行測(cè)定，將96孔板37℃預(yù)熱，加入150 μL熒光素溶液到96孔板中，隨后加入25 μL Trolox標(biāo)品和待測(cè)樣品，37℃孵育10 min；隨后加入25 μL 2, 2′-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽工作液，在520 nm處測(cè)量吸光度值。ORAC值表示為每千克干重肉的Trolox毫摩爾當(dāng)量（mmol Trolox Eq./kg干肉）。

1.2.1.6 N, N-二甲基-對(duì)苯二胺（N, N-dimethyl-pphenylendiamine，DMPD）總抗氧化能力測(cè)定 參考FOGLIANO等[18]方法進(jìn)行測(cè)定，將0.05 mol·L-1氯化鐵、100 mmol·L-1DMPD 的水溶液和 100 mmol·L-1醋酸緩沖液按 2∶10∶1000（v/v/v）的比例混合（pH 5.25），制備DMPD工作液。將10 mg肉粉-纖維素（1∶1）樣品加入到15 mL離心管中，添加10 mL DMPD工作溶液開始反應(yīng)，避光渦旋30 s使試管充分混合，于室溫避光條件下在軌道搖床上以 200 r/min的速度搖晃混合物，以促進(jìn)肉樣顆粒和FRAP溶液之間的充分反應(yīng)，將自由基溶液引入肉樣品60 min后，699×g離心2 min，取上清液（200 μL）轉(zhuǎn)移到96孔板中，并在505 nm處測(cè)定吸光度值。FRAP活性表示為每千克干重肉的Trolox毫摩爾當(dāng)量（mmol Trolox Eq./kg干肉）。

1.2.2 游離氨基酸測(cè)定 參考ZOU等[19]方法，稍作修改。稱取3 g左右絞碎的鮮肉樣品，加入20 mL 5-磺基水楊酸（3 g/100 mL）均質(zhì)（6 000 r/min，2×20 s），4℃下10 000×g離心15 min，取上清液定容至25 mL。稱取2 mL正己烷于上清液中，混勻振蕩（60 s），10 000×g離心10 min后取下層溶液，最后通過0.22 μm水相濾膜過濾后，采用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)游離氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以mg/100 g鮮肉表示。

1.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 根據(jù)抗氧化能力和游離氨基酸結(jié)果，選擇宰后0.5、6和48 h的灘羊肉進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，具體參考鄒波等[20]的方法，對(duì)裂解液配方濃度和離心力大小作適當(dāng)修改。

1.2.3.1 總蛋白提取 取-80℃保存的灘羊肉樣品在液氮中研磨成粉，按照1∶10比例（W/V）加入裂解液（7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、0.1% 3-(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺酸、1%蛋白酶抑制劑），渦旋混勻，采用組織研磨儀磨成勻漿，冰上靜置 30 min；16 200×g條件下，4℃離心15 min，取上清液。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，采用SDS-PAGE法對(duì)蛋白樣品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)測(cè)。

1.2.3.2 總蛋白酶解 取蛋白質(zhì)量為 25 μg的上清液，加入到10 kD超濾管（Milipore）中，按照40∶1（V/V）加入1 mol·L-1二硫蘇糖醇溶液（終濃度為25 mmol·L-1），渦旋混勻，37℃水浴1 h；隨后，按照20∶1（V/V）加入 1 mol·L-1碘乙酰胺溶液（終濃度為50 mmol·L-1），渦旋混勻，避光室溫放置30 min；隨后，加入 300 μL 20 mmol·L-1的四乙基溴化銨，13 800×g離心10 min，收集底部溶液，重復(fù)操作3次；隨后，加入2%的胰蛋白酶（Promege），37℃消化12 h；最后，加入四乙基溴化銨，13 800×g離心10 min，收集管底部溶液，重復(fù)3次。

1.2.3.3 固相萃取 采用ZipTip C18固相萃取柱對(duì)酶切的多肽溶液進(jìn)行萃取，采用10 μL 100%乙腈對(duì)萃取柱進(jìn)行活化，采用10 μL 2%乙腈-0.1%甲酸溶液平衡萃取柱。上樣后采用10 μL 2%乙腈-0.1%甲酸溶液進(jìn)行清洗脫鹽（重復(fù)5次），采用50%乙腈-0.1%甲酸溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液真空抽干后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.4 LC-MS/MS分析 將多肽組分重溶于 10 μL 0.1%甲酸溶液中，經(jīng)過EASY-nLC液相，低pH反相C18毛細(xì)管色譜柱（150 μm×150 mm，1.9 μm）分離，A相為0.1%甲酸，B相為80%乙腈和0.1%甲酸，線性洗脫，流動(dòng)相B從12%到100%，總洗脫時(shí)間為120 min，流速為 0.6 μL·min-1。

采用Orbitrap Q-Exactive HF質(zhì)譜儀分析鑒定多肽混合物，噴霧電壓2 200 V，離子源溫度320℃，選擇高靈敏度模式，每個(gè)全掃描為高速信號(hào)依賴掃描，掃描時(shí)間為120 min。一級(jí)全掃描分辨率為60 000，掃描范圍為300—1 500 m/z，AGC為3e6，最大注射時(shí)間為80 ms；每一個(gè)一級(jí)掃描后篩選前20個(gè)離子進(jìn)入碰撞池打碎，碰撞能量為30%，二級(jí)掃描分辨率為15 000，電荷狀態(tài)篩選（包含+2—+6電荷的前體），動(dòng)態(tài)消除20 s。

1.2.3.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、蛋白質(zhì)定量、功能分析 所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)MaxQuant（version 1.5.3.8）檢索匹配和定量分析，使用數(shù)據(jù)庫(kù)為：uniprot_proteome_UP000002356_sheep_23111_20200310.fasta（序列總數(shù)：23 111）。采用Perseus（1.5.5.1）軟件進(jìn)行相關(guān)性和PCR分析?；跇颖炯夹g(shù)重復(fù)間蛋白定量比值的分布，確定篩選差異蛋白 ratio的閾值。選取2組樣本間蛋白ratio≤1-2SD或ratio≥1+2SD作為篩選差異蛋白ratio的閾值，以P＜0.05、差異倍數(shù)＞1.5或＜0.67作為閾值，選取差異蛋白。采用OmicsBox（版本：1.2.4）軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能注釋分析和GO富集分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理組 6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品測(cè) 2—3次，取平均值。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，選用Duncan’s法進(jìn)行多重比較分析，采用 Person進(jìn)行相關(guān)性比較；結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.01為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 宰后不同時(shí)間灘羊肉抗氧化活性

如圖1所示，宰后48 h內(nèi)，灘羊肉中FRAP總抗氧化能力呈先下降后上升的趨勢(shì)。宰后3 h灘羊肉中FRAP總抗氧化能力最低，且顯著低于宰后0.5 h和6 h的水平（P＜0.05）。宰后3 h以后，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，灘羊肉中FRAP總抗氧化能力呈上升趨勢(shì)，宰后6、12和48 h之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

宰后48 h內(nèi)，灘羊肉中ABTS自由基清除能力呈先升高后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。宰后0.5、3和6 h之間，灘羊肉中ABTS自由基清除能力存在顯著性差異（P＜0.05）；宰后6、12和48 h，灘羊肉ABTS自由基清除能力差異不顯著（P＞0.05）（圖2-A）。

宰后48 h內(nèi)，灘羊肉中DPPH和DMPD自由基清除能力整體均呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)。宰后0.5 h和3 h灘羊肉中DPPH和DMPD自由基清除能力差異不顯著（P＞0.05）。宰后6、12和48 h灘羊肉中DPPH和DMPD自由基清除能力顯著高于宰后0.5 h水平（P＜0.05）。同時(shí)，宰后6、12和48 h之間均存在顯著性差異（P＜0.05）（圖2-B、C）。

灘羊肉中ORAC在宰后48 h內(nèi)整體呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)。宰后0.5 h和3 h灘羊肉中ORAC差異顯著（P＜0.05），宰后6、12和48 h灘羊肉中ORAC顯著增加（P＜0.05）（圖2-D）。

2.2 宰后不同時(shí)間灘羊肉中游離氨基酸含量

如表1所示，灘羊肉中游離氨基酸的總含量為1 085.16—1 100.43 mg/100 g，不同時(shí)間點(diǎn)游離氨基酸總含量差異不顯著（P＞0.05）。灘羊肉中主要的游離氨基酸為肌肽（499.15—555.97 mg/100 g）、鵝肌肽（197.54—213.93 mg/100 g）、谷氨酸（108.09—120.10 mg/100 g）、?；撬幔?0.26—92.20 mg/100 g）、丙氨酸（49.53—52.07 mg/100 g）和甘氨酸（20.13—21.40 mg/100 g）等，以上氨基酸的含量在不同時(shí)間點(diǎn)基本不存在顯著性差異（P＞0.05）。胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸的含量在不同時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異（P＜0.05），并且總體呈增加的趨勢(shì)，宰后48 h灘羊肉中的含量顯著高于宰后0.5 h的灘羊肉（P＜0.05）。

表1 宰后不同時(shí)間灘羊肉中游離氨基酸含量Table 1 Free amino acid contents of Tan lamb in different postmortem time

與FRAP顯著相關(guān)的游離氨基酸有7個(gè)，均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，包括鄰磷酸絲氨酸（r=0.489，P＜0.01）、亮氨酸（r=0.566，P＜0.01）、酪氨酸（r=0.596，P＜0.01）、異亮氨酸（r=0.374，P＜0.05）、苯丙氨酸（r=0.499，P＜0.01）、賴氨酸（r=0.375，P＜0.05）和精氨酸（r=0.376，P＜0.05）。其中，亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸與FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）（表2）。

表2 灘羊肉中游離氨基酸含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 2 Person’s correlation between amino acids contents and antioxidant activity in Tan lamb

2.3 宰后不同時(shí)間灘羊肉蛋白質(zhì)組

根據(jù)宰后不同時(shí)間灘羊肉抗氧化活性結(jié)果，選擇宰后0.5、6和48 h的灘羊肉進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，總共鑒定出1 030個(gè)蛋白（其中787個(gè)為共定量蛋白），共有971個(gè)蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)中有其對(duì)應(yīng)的GO條目。通過對(duì)灘羊肉蛋白質(zhì)組進(jìn)行主成分分析（圖3），3個(gè)處理組不能完全分開，表明宰后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的灘羊肉蛋白質(zhì)組差異有限。以P＜0.05、差異倍數(shù)＞1.5或＜0.67作為閾值，篩選出宰后不同時(shí)間的灘羊肉中存在差異蛋白20個(gè)，如圖4所示，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，上調(diào)的蛋白有伴肌動(dòng)蛋白（W5PFV9）、糖原蛋白 1（W5P5C5）、H15 結(jié)構(gòu)域蛋白（W5NS65）、肽基脯氨酰異構(gòu)酶（W5PHT7）、電壓門控鈣離子通道輔助亞基 α2δ-1（W5Q466）、脯氨酸/精氨酸豐富端亮氨酸豐富重復(fù)蛋白（W5NUA0）、泛素羧基末端水解酶（W5Q922）、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（W5QG38）、苯丙氨酰-tRNA合成酶 β（W5QGI4）、H1組蛋白家族成員0（W5QGM7）；下調(diào)的蛋白有鈣蛋白酶抑制蛋白（C3V6M4）、輔酶 Q8A（W5NTS5）、親聯(lián)蛋白 1（W5P8Z2）、蛋白酶體26S亞基ATP合酶（W5P9K6）、亮氨酸拉鏈和CTNNBIP1結(jié)構(gòu)域（W5PA76）、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基2（W5NRQ5）、真核細(xì)胞翻譯起始因子4H（W5PQJ1）、胞膜窖相關(guān)蛋白4（W5PCH1）以及 2個(gè)未知蛋白（W5PID4、W5PP64）。

對(duì)宰后不同時(shí)間灘羊肉中的差異蛋白進(jìn)行GO組分富集分析（圖5），這些蛋白主要參與生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能。其中，參與生物學(xué)過程的蛋白主要涉及核小體的組織、組裝等；在細(xì)胞組分中，富集的功能包括核小體、DNA包裝復(fù)合體、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體等；在分子功能中，蛋白質(zhì)主要參與電壓門控性鈣通道活性、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶活性、胞苷脫氨酶活性等過程。

3 討論

3.1 宰后不同時(shí)間的灘羊肉抗氧化活性變化

由于肉品是復(fù)雜體系，難以用單一的方法確定其抗氧化活性。本研究采用FRAP總抗氧化能力、ORAC、DPPH、DMPD、ABTS自由基清除能力等5種方法評(píng)價(jià)宰后不同時(shí)間灘羊肉的抗氧化活性，其中，DPPH、ABTS、FRAP三種抗氧化均屬于單電子轉(zhuǎn)移（ET）機(jī)制，是體外評(píng)價(jià)活性物質(zhì)抗氧化能力的常見方法，操作簡(jiǎn)單[21-23]。ORAC是指氧化自由基吸收能力，是國(guó)際上衡量抗氧化能力的通用指標(biāo)[24]；DMPD是一種有機(jī)自由基前提物，在酸性條件下可被Fe3+、H2O2等氧化形成有色自由基，被用來測(cè)定水溶性樣品的抗氧化能力[21]。

動(dòng)物屠宰后，血液循環(huán)停止，肌細(xì)胞中的氧化-還原平衡被打破，由于缺乏能量的持續(xù)供給，肌細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)氧化損傷。正?；铙w內(nèi)，機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御體系主要由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶保護(hù)體系和由維生素C、維生素E、胡蘿卜素等物質(zhì)組成的非酶保護(hù)體系共同構(gòu)成[25]。宰后肌肉中的抗氧化物質(zhì)含量和活性會(huì)隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消耗，直至無法有效降低活性氧自由基對(duì)肌肉的損耗，從而影響肉品品質(zhì)變化，樊路杰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，宰后肌肉氧化反應(yīng)的程度與肉色、保水性、貨架期長(zhǎng)短密切相關(guān)。之前研究多數(shù)集中在宰后貯藏過程中蛋白質(zhì)、脂肪氧化對(duì)肉品質(zhì)的影響，而對(duì)宰后早期（48 h內(nèi)）肌肉中抗氧化能力的研究較少。本研究中，隨著宰后貯藏時(shí)間延長(zhǎng)（0—48 h），灘羊肉中FRAP、DMPD、ORAC、DPPH總抗氧化能力總體呈上升趨勢(shì)。宰后48 h內(nèi)，肌肉經(jīng)歷著僵直、解僵成熟過程，肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生巨大變化，肌細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，能量代謝酶、細(xì)胞凋亡酶、鈣激活酶等發(fā)揮作用，肌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行著復(fù)雜的代謝活動(dòng)，盡可能維持細(xì)胞的平衡狀態(tài)。本研究證實(shí)宰后早期48 h內(nèi)灘羊肉具有較強(qiáng)的自由基清除能力。

宰后不同時(shí)間灘羊肉20個(gè)差異蛋白中，與FRAP顯著相關(guān)的差異蛋白有12個(gè)，其中與鈣蛋白酶抑制蛋白、真核細(xì)胞翻譯起始因子 4H、亮氨酸拉鏈和CTNNBIP1結(jié)構(gòu)域、未知蛋白2等4個(gè)蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與親聯(lián)蛋白1和蛋白酶體26S亞基 ATP合酶呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；與H15結(jié)構(gòu)域蛋白、肽基脯氨酰異構(gòu)酶呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與糖原蛋白1、伴肌動(dòng)蛋白、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白、H1組蛋白家族成員0等4個(gè)蛋白呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。鈣蛋白酶抑制蛋白和未知蛋白 2與 FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），其中鈣蛋白酶抑制蛋白與DPPH呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），未知蛋白2與ABTS、DPPH、ORAC、DMPD呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。而糖原蛋白1和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白與 FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

3.2 宰后不同時(shí)間灘羊肉中游離氨基酸變化

本研究中，肌肽、鵝肌肽、谷氨酸、?；撬?、丙氨酸和甘氨酸是灘羊肉中主要的游離氨基酸，與 OH等[16]在Hanwoo牛肉上的研究結(jié)果一致。OH等[16]研究發(fā)現(xiàn)，肌肽是Hanwoo牛10個(gè)部位中最豐富的游離氨基酸，其次為鵝肌肽、谷氨酸、牛磺酸和丙氨酸。肌肽又稱β-丙氨酰-L-組氨酸，是天然存在于肌肉中的水溶性二肽，具有清除自由基、螯合轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子、淬滅單線態(tài)氧等抗氧化性質(zhì)[26-27]；鵝肌肽又稱β-丙氨酰-1-甲基-L-組氨酸，具有水溶性和顯著的抗氧化、抗衰老、降尿酸等功能[28]。牛磺酸又稱2-氨基乙磺酸，是機(jī)體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸，是人體健康必不可少的一種營(yíng)養(yǎng)素，具有多種生理功能，是嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的必需氨基酸，可促進(jìn)大腦生長(zhǎng)發(fā)育，有助于預(yù)防心血管疾病、高血壓、糖尿病等[29]。本研究中，灘羊背最長(zhǎng)肌中肌肽、?；撬岬暮扛哂诘驴速悹栯s交羔羊背最長(zhǎng)肌中肌肽（458 mg/100 g）和?；撬幔?7.3 mg/100 g）的含量[30]以及Hanwoo牛肋脊部肉中的含量[16]。HOU等[31]和TRIKI等[32]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸是羊肉的主要游離氨基酸，而牛肉中主要的游離氨基酸是天冬氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸[33]。肌肉中游離氨基酸的含量受品種、部位、貯藏時(shí)間等因素的影響[16,32,34-35]；另外，由于測(cè)定方法的差異，部分研究沒有測(cè)定?；撬?、肌肽、鵝肌肽等游離氨基酸含量。

表3 灘羊肉中差異蛋白豐度與抗氧化活性的相關(guān)性Table 3 Person’s correlation between differentially abundant proteins and antioxidant activity in Tan lamb

本研究表明，宰后灘羊肉中胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，這與之前研究結(jié)果一致[34-35]；宰后48 h內(nèi)，灘羊肉中游離氨基酸的總量沒有發(fā)生顯著變化，表明本研究中灘羊肉中蛋白質(zhì)沒有發(fā)生大量水解，與之前的研究結(jié)果一致[36]。生鮮肉的抗氧化活性受到諸多因素的影響，如維生素、多酚、脂肪酸、氨基酸、酶等[8,13,34]。WU等[37]研究表明，馬鮫魚肉在貯藏過程中，游離氨基酸和肽的變化與抗氧化活性顯著相關(guān)。另有研究表明，不穩(wěn)定的氨基酸側(cè)鏈，如半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、組氨酸和苯丙氨酸，在含有低能量自由基的體系中可作為抗氧化劑[38]。本研究中，胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸的含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，并且亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸與FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，部分結(jié)果與PéREZ等[39]在蜂蜜上的研究結(jié)果一致。因此，推測(cè)宰后不同貯藏時(shí)間灘羊肉抗氧化能力的變化與氨基酸含量有關(guān)。本研究關(guān)于DPPH自由基清除能力的結(jié)果與FU等[40]和LIU等[41]在宰后成熟過程中牛肉和鴨肉上的研究結(jié)果一致，DPPH自由基清除能力與宰后成熟過程中生物活性肽的釋放和游離氨基酸含量的變化有關(guān)。

3.3 宰后不同時(shí)間灘羊肉蛋白質(zhì)質(zhì)組變化

本研究篩選出宰后不同時(shí)間灘羊肉的差異蛋白20個(gè)，差異蛋白的數(shù)量與師希雄等[42]在牦牛肉上的研究結(jié)果相當(dāng)，其鑒定出牦牛肉成熟前后18個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中14個(gè)蛋白質(zhì)在成熟過程中表達(dá)量下降，包括代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白以及應(yīng)激蛋白。本研究中，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量上升的蛋白有伴肌動(dòng)蛋白、肽基脯氨酰異構(gòu)酶、電壓門控鈣離子通道輔助亞基α2δ-1、脯氨酸/精氨酸豐富端亮氨酸豐富重復(fù)蛋白、泛素羧基末端水解酶、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白、苯丙氨酰-tRNA合成酶β等。伴肌動(dòng)蛋白存在于肌節(jié)的I帶中，連接細(xì)肌絲與Z區(qū)，并將肌動(dòng)蛋白單體連接在一起，通常在宰后1 d后開始降解[43]。泛素羧基末端水解酶，是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的重要成員，具有去泛素化的作用[44]；苯丙氨酰-tRNA合成酶β在蛋白質(zhì)生物合成中具有重要作用，其在氧化應(yīng)激下可逆性失活[10]；肽基脯氨酰異構(gòu)酶通過加速脯氨酸肽鍵的順反異構(gòu)化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能[45]；電壓門控鈣離子通道輔助亞基α2δ-1對(duì)電壓門控鈣通道具有重要的調(diào)節(jié)作用，參與維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[46]。本研究鑒定出的其他差異蛋白通過功能預(yù)測(cè)表明參與細(xì)胞生物學(xué)過程、分子功能等。

鈣蛋白酶抑制蛋白是一種內(nèi)源性、需Ca2+的鈣蛋白酶抑制蛋白，通過抑制μ-鈣蛋白酶活性影響宰后肌肉嫩化進(jìn)程[47-48]。宰后肌肉中鈣蛋白酶抑制蛋白的含量逐漸減少，其被降解和失活的速度與肌肉中蛋白質(zhì)的水解和肉嫩度有關(guān)，通過與μ-鈣蛋白酶之間的相互作用共同參與調(diào)控宰后肌肉的嫩度[49]。本研究中，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，灘羊肉中鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)量下降，與前人研究一致。親聯(lián)蛋白1是一種位于骨骼肌三聯(lián)管處的蛋白，連接橫管和肌漿網(wǎng)，對(duì)維持三聯(lián)管穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。缺失親聯(lián)蛋白1可導(dǎo)致肌漿網(wǎng)崩解[50]，本研究中，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，灘羊肉中親聯(lián)蛋白 1的表達(dá)量下降，表明宰后肌肉僵直、解僵過程中，肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，解離后的親聯(lián)蛋白1容易被肌漿中的蛋白質(zhì)水解酶降解，導(dǎo)致表達(dá)量下降。輔酶Q也叫泛醌（Ubiquinone），是一類脂溶性醌類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化能力[51]。胞膜窖（Caveolae）是細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的一種特殊的脂筏結(jié)構(gòu)，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[52]。26S蛋白酶體是細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)降解的主要分子機(jī)器，參與生物體的大多數(shù)生命活動(dòng)[53]，而ATP合酶是生物體能量轉(zhuǎn)換的核心酶[54]。真核細(xì)胞翻譯起始因子、亮氨酸拉鏈和 CTNNBIP1結(jié)構(gòu)域、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基2等在肌肉代謝中發(fā)揮著重要作用[55-56]。

本研究中，鈣蛋白酶抑制蛋白和未知蛋白 2與FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而糖原蛋白 1和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白與FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。王磊[57]研究表明，抗氧化蛋白、分子伴侶蛋白和一些酶類參與調(diào)節(jié)宰后機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和氧化還原調(diào)節(jié)等過程，從而間接導(dǎo)致其肉色的差異。這表明，鈣蛋白酶抑制蛋白、未知蛋白2、糖原蛋白 1和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白可作為表征宰后肌肉抗氧化活性的潛在標(biāo)志物。綜上，宰后初期肌肉中進(jìn)行著復(fù)雜的代謝活動(dòng)，代謝酶、伴侶蛋白、應(yīng)激蛋白等參與宰后早期肌肉氧化還原調(diào)節(jié)過程，下一步將從分子代謝通路角度闡釋宰后初期肌肉抗氧化活性變化的機(jī)制。

4 結(jié)論

宰后48 h內(nèi)，灘羊肉總抗氧化能力總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且抗氧化能力的升高與宰后肌肉中亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等游離氨基酸的釋放有關(guān)；宰后初期，肌肉中鈣蛋白酶抑制蛋白、未知蛋白2等蛋白表達(dá)量的下降和糖原蛋白 1、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白等蛋白表達(dá)量的上升與宰后灘羊肉抗氧化能力的變化顯著相關(guān)。