張璐，宗亞奇，徐維華，韓蕾，孫湞育，陳朝暉，陳松利，張凱，程杰山，唐美玲,?，張洪霞，宋志忠?

1魯東大學農林工程研究院/山東省高等學校重點實驗室-作物高產抗逆分子模塊育種實驗室，山東煙臺 264025；2煙臺農業(yè)科學研究院葡萄研究所，山東煙臺 264000；3招遠市大戶莊園農林專業(yè)合作社，山東煙臺 264000

0 引言

【研究意義】鐵是植物正常生命活動所必需的微量礦質元素[1-2]，是細胞色素、鐵硫（Fe-S）蛋白的組成成分[3]，與植物生長發(fā)育、花的形成和果實品質與產量密切相關，缺鐵嚴重影響植物生長，降低果實產量和品質[4-7]。Fe-S簇是 Fe-S蛋白的活性部位，雖然其組成元素和結構都較為簡單，但是Fe-S簇的組裝是需多種組裝蛋白參與的有序進行的催化反應，是活細胞中一個高度復雜和協(xié)調的過程[8-11]。由此可見，F(xiàn)e-S簇裝配機制是植物鐵素營養(yǎng)和鐵代謝的核心環(huán)節(jié)，在植物的生命過程中具有至關重要的作用。鑒定和克隆果樹Fe-S簇裝配基因為研究果樹Fe-S簇裝配機制提供參考，并為解析果樹鐵素營養(yǎng)和代謝奠定理論基礎?！厩叭搜芯窟M展】在植物中，F(xiàn)e-S蛋白在呼吸、光合、硫和氮同化、氨基酸和嘌呤代謝、植物激素和輔酶合成，DNA修復和翻譯等過程中發(fā)揮重要作用[8-10]，大多數(shù)代謝途徑和細胞過程發(fā)生在亞細胞部位，并依賴于 Fe-S蛋白[3,12]。研究表明 Fe-S蛋白存在于質體、線粒體、細胞質和細胞核中，對許多生理和代謝過程必不可少，例如，硝酸還原酶（nitrite reductase，NIR）在葉綠體中氮的同化過程至關重要，烏頭酸酶（aconitase，ACO）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）是參與線粒體糖代謝檸檬酸循環(huán)的關鍵酶[9]。特別地，F(xiàn)e-S簇是Fe-S蛋白的輔因子，在光合作用、呼吸和 DNA修復中起著不可或缺的作用[11,13-15]。植物中，一個高度保守的Fe-S簇裝配過程包括在組裝支架上形成Fe-S簇，并轉移到目標載體蛋白上，涉及硫供體（NFS）、鐵供體、支架（SUFB、SUFC、SUFD、NFU等）以及轉運蛋白（ISA、GRX、HSCA）等 40多個編碼基因[9,12]，其中，模式植物擬南芥中Fe-S簇裝配機制的研究最為深入和透徹，目前已經確定了3種Fe-S簇裝配機制，即質體中存在SUF（sulfur mobilization）裝配機制[16]，線粒體中采用ISC（iron-sulfur cluster）裝配機制[16]，這兩種機制均以獨立的方式運行，而細胞質中的Fe-S簇組裝是新出現(xiàn)的一種依賴于線粒體的CIA（cytosolic iron-sulfur cluster assembly）裝配機制[16]。在這3種機制中，F(xiàn)e-S簇的裝配過程均可分為兩個階段：第一階段，即 S和 Fe結合在支架蛋白上，第二階段，將Fe-S簇轉移到靶蛋白。其中，第二階段可能涉及具有特殊功能的不同的載體蛋白[9-16]?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，國內外對植物 Fe-S簇裝配分子機制的研究主要集中在一年生植物，包括擬南芥[12]、水稻[17]和大豆[18]等，果樹學中研究較少，僅在桃[19-20]中有報道，葡萄中Fe-S簇裝配機制及其分子基礎依然未知?！緮M解決的關鍵問題】本研究以‘馬瑟蘭’葡萄為材料，克隆葡萄Fe-S簇裝配機制相關基因并鑒定其生物信息學特征，明確其在葡萄不同組織部位的表達特征，為研究葡萄Fe-S簇裝配和果樹鐵素營養(yǎng)與代謝的分子機制提供基因資源和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2019年6月至2020年12月在魯東大學農林工程研究院和“十三五”山東省高等學校重點實驗室——作物高產抗逆分子模塊育種實驗室進行。

1.2 試驗材料與處理

供試材料為煙臺地區(qū)主栽釀酒葡萄品種‘馬瑟蘭’，由山東省煙臺市農業(yè)科學研究院果樹所提供，種植在招遠市大戶莊園農林專業(yè)合作社試驗基地，樹體健壯，南北行向，常規(guī)田間管理。分別于特定日期采集‘馬瑟蘭’的果實，包括幼果期（2019年6月30日）、硬核期（7月15日）、膨大期（8月3日）、轉色期（8月17日）和成熟期（9月15日），以及葡萄幼葉（6月30日）和老葉（9月15日），樣品采集后立即液氮冷凍并保存于-80℃低溫冰箱中備用。

脅迫試驗供試材料為山東省煙臺市農業(yè)科學研究院果樹所提供的‘馬瑟蘭’組培脫毒幼苗。自 2019年11月起，進行‘馬瑟蘭’組培脫毒苗的接種培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為1/2 MS固體培養(yǎng)基。組培室環(huán)境溫度為25℃，濕度70%，光照3 000 lx。接種后的幼苗于一個月左右生根，繼而長葉。培養(yǎng)近兩個月即可將培養(yǎng)瓶放置于普通室內環(huán)境中，逐漸開蓋進行3 d煉苗處理，早晚噴灑去離子水。幼苗生長狀況良好的情況下，置于蛭石珍珠巖基質中，用正常MS培養(yǎng)液作為對照處理，用不含鐵離子的MS培養(yǎng)液進行缺鐵脅迫處理，早晚澆營養(yǎng)液，處理96 h后，分別采集處理幼苗的根部、莖部和葉部材料，立即液氮冷凍并保存于-80℃冰箱中備用。

1.3 葡萄Fe-S簇裝配基因克隆

以擬南芥中43個Fe-S簇裝配基因的氨基酸序列為參考序列，在 Phytozome Grape Genome Database（http://www.phytozome.net）中檢索葡萄基因組中相對應的Fe-S簇裝配基因，以與參考序列比對的覆蓋面積＞90%且同源性＞75%為篩選參數(shù)。檢索結果在Pfam（http://pfam.xfam.org/search）在線服務器預測功能結構域。根據(jù)Phytozome獲得的葡萄Fe-S簇裝配基因的CDS（coding sequence）電子序列，分別設計上、下游引物（表1），利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）從‘馬瑟蘭’整株組培苗中擴增目的基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

1.4 葡萄Fe-S簇裝配基因的生物信息學分析

參考 LIANG 等[17]和 SONG 等[20]的報道，在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中獲得Fe-S簇裝配基因的CDS編碼區(qū)序列及基因組DNA序列和編碼氨基酸序列，然后通過Gene Structure Display（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在線服務器進行基因結構分析；利用 WoLF PSORT在線服務器（https://wolfpsort.hgc.jp/）預測葡萄Fe-S簇裝配基因的亞細胞定位；參考SONG等[20]報道，在Phytozome基因組中下載擬南芥 AtISU1（At4g22220）、水稻 OsISU1（Os01g47340）、大豆GmISU1（Glyma05g02260.1）、短柄草BdISU1（Bra020855）、番茄SlISU1（Solyc03g112900）、柑橘 CsISU1（orange1.1g030644m）、蘋果 MdISU1（MDP0000778166）和桃 PeISU1（ppa012356m），根據(jù)王壯偉等[21]描述，利用分子進化遺傳分析軟件MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining）構建不同植物ISU1蛋白的系統(tǒng)進化樹。

1.5 總RNA提取與實時熒光定量PCR分析

采集田間葡萄樹體不同發(fā)育時期的果實和葉片，通過RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）（TIANGEN，北京）提取葡萄樣品的總RNA，并利用Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）100rxn（TIANGEN，北京）合成第一鏈cDNA作為模板，采用 Perfect Start Green qPCR Super Mix（TransGen，北京）進行實時熒光定量 PCR。利用NCBI/PrimerBLAST在線服務器，設計葡萄Fe-S簇裝配基因的特異性表達引物（表2）。以葡萄內參基因Ubiquitin（GenBank No. MH114011）[21-22]，通過BIO-RAD實時熒光定量PCR儀檢測葡萄Fe-S簇裝配基因在不同組織部位的表達特征。反應體系參照商品說明書的描述，反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s（40個循環(huán)）；72℃ 10 s。每個樣品進行 3次生物學重復，不同樣品在實時熒光定量PCR儀獲得相應的Ct值，經內參基因Ubiquitin均一化處理后，采用2-ΔCT法計算基因的相對表達量[21-22]。根據(jù)DENG等[23]描述，通過 Log2計算法分析缺鐵脅迫前后表達倍數(shù)，通過HemI軟件制作表達差異變化的熱圖。分別以對照植物根、莖或葉的表達值設定為 1，若缺鐵脅迫條件下的表達值＜1，表示基因表達水平被下調；表達值＞1，則表示基因表達水平被上調。

2 結果

2.1 葡萄Fe-S簇裝配基因檢索與鑒定

以擬南芥 Fe-S簇裝配基因的氨基酸序列為參考序列[12]，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到46個Fe-S簇裝配基因。其中，14個基因屬于質體SUF機制，21個基因屬于線粒體 ISC機制，11個基因屬于細胞質CIA機制（圖1、表3）。與擬南芥相比，葡萄基因組中缺少了 ISU2、ISU3、NFU5和 ADX2，但增加了擬南芥中沒有的HSCA3-7、NBP35-2和CIA3；與桃相比[19-20]，葡萄基因組中缺少了 ADX2，但增加了桃中沒有的SUFC、HSCA6和HSCA7；與單子葉植物水稻相比[17]，葡萄基因組中缺少了ISU2和ADX2，但檢索到水稻中沒有的SUFE2、HSCA3-7、NBP35-2和CIA3（表3）。

2.2 葡萄Fe-S簇裝配基因及其編碼蛋白特征

除NFS1、HSCA2和NAR1染色體定位情況未知外，其他43個葡萄Fe-S簇裝配基因在除了5號染色體之外的16條染色體上均有分布；其中，8號染色體含有的基因數(shù)目最多，共6個（GRXS16、ISA1、ISA3、HSCB、CIA1和CIA3），7號染色體含有5個（SUFA、NFU1、ISA2、INDL、NBP35-2），其他染色體上至少含有一個基因；同一基因家族中的成員ISA1和ISA3、CIA1和CIA3均位于8號染色體（表3），然而，同屬于HSCA基因家族的7個成員分布于截然不同的染色體上，但其CDS長度較為接近，均在1 500—2 000 bp（表4）。

表3 葡萄、擬南芥和桃Fe-S簇裝配基因對比Table 3 Complete list of Fe-S cluster assembly genes in grape, Arabidopsis and peach species

表4 葡萄Fe-S簇裝配基因信息Table 4 Information of Fe-S cluster assembly genes in grape

基因結構分析結果表明葡萄 Fe-S簇裝配基因均含有內含子，其中，GRXS16和ISD11僅含有1個內含子，而MMS19含有的內含子數(shù)目最多（21個），且長度不一（表4、圖2）。但SUFD含有2個內含子，第2個內含子的長度超過20 kb。

2.3 葡萄Fe-S簇裝配基因亞細胞定位預測

由亞細胞定位預測結果可知，葡萄Fe-S簇裝配機制相關蛋白在多種亞細胞結構中均有定位，且不同裝配機制的蛋白亞細胞定位情況差異很大（表 5）。其中，質體SUF裝配機制的蛋白主要定位在葉綠體中，而SUFE1主要定位于細胞核，SUFE3主要定位于細胞質，此外部分蛋白成員在線粒體、內質網(wǎng)膜、液泡膜和細胞質膜也有不同比例的分布；線粒體ISC裝配機制中，HSCA4和HSCA6是100%定位在內質網(wǎng)膜，其他成員中，10個主要定位于葉綠體，6個主要定位于線粒體，3個（HSAC3、HSAC5和INDL）主要定位于細胞質。此外，ISC裝配機制的蛋白在細胞核、液泡膜、細胞質膜和高爾基體有不同比例的定位；細胞質CIA裝配機制中，CIA3是100%定位在細胞質，其他成員中，6個主要定位于細胞核，3個（NAR1、NBP35-2和CIA2）主要定位于細胞質，ATM3主要在細胞質膜，NBP35-1主要在葉綠體；此外，CIA裝配機制的蛋白在液泡膜、內質網(wǎng)膜、線粒體和高爾基體也有不同比例的定位（表5）。

表5 Fe-S簇裝配基因亞細胞定位預測Table 5 Subcellular localization prediction of Fe-S cluster assembly gene

2.4 葡萄Fe-S簇裝配基因的表達特征分析

實時熒光定量PCR分析結果表明，葡萄Fe-S簇裝配基因在成年‘馬瑟蘭’葡萄不同組織部位的表達水平差異較大：其中，ISU1在整體水平的表達量最高（特別是在成熟果實、老葉和幼葉中的表達量極高），其次是HSCA1、ISA2、NFU2、SUFA和SUFB等基因的整體表達水平較高，而 SUFE2、NFS1、HSCA2、HSCA6、TAH18和CIA2均未檢測到表達量，其他未提及的基因在本研究所有不同葡萄組織材料中有較低或極低的表達量（圖3）。

在本研究所檢測的不同葡萄組織材料中，13個葡萄Fe-S簇裝配基因（SUFA、SUFB、NFU3、HCF101、GRXS14、GRXS16、ISA1、ISA2、FH、IBA57、GRXS15、ATM3和MMS19）在成熟葉片中的表達量最高，NFS2、SUFE1、NFU1、ISA3、NFU4、ADX1、NAR1 和 DRE2等8個基因在幼苗葉片的表達最高，而ISD11、ISU1、IBA57、HSCB、NBP35-1、CIA1和CIA3等6個基因在成熟期果實中的表達量最高，其表達水平隨著果實的逐漸發(fā)育而遞增，均在成熟期果實中達到最高；此外，除HSCA2和HSCA6沒有檢測到外，其他5個HSCA家族成員均在轉色期果實中的表達量最高（圖3）。

2.5 葡萄 Fe-S簇裝配基因對缺鐵脅迫的響應差異分析

以‘馬瑟蘭’組培幼苗為材料，通過實時熒光定量PCR分析葡萄Fe-S簇裝配基因在轉錄水平對缺鐵脅迫的響應情況。如圖4所示，葡萄Fe-S簇裝配基因對缺鐵處理較為敏感，所有46個基因至少在1個檢測的組織部位對缺鐵處理有響應，表達量發(fā)生顯著變化。其中，22個基因（NFS2、SUFE1、SUFE3、SUFB、SUFC、NFU1、NFU2、NFU3、GRXS14、NFS1、ISA1-3、FH、HSCA4、HSCA6、HSCA7、AMT3、NAR1、TAH18、CIA1和CIA2）對缺鐵脅迫最敏感，其表達水平在‘馬瑟蘭’幼苗所有檢測組織中均受缺鐵處理的影響而發(fā)生顯著變化（圖4）。根部中，24個葡萄Fe-S簇裝配基因在轉錄水平的表達量受缺鐵處理而降低，12個基因的表達量增強，10個基因的表達量沒有顯著變化；莖部中，14個葡萄 Fe-S簇裝配基因在轉錄水平的表達量受缺鐵處理而降低，22個基因的表達量增強，10個基因的表達量沒有顯著變化；葉片中，9個葡萄Fe-S簇裝配基因在轉錄水平的表達量受缺鐵處理而降低，27個基因的表達量被增強，10個基因的表達量沒有顯著變化（圖4）。

3 討論

不管是原核生物還是真核生物，F(xiàn)e-S簇裝配機制是極其復雜和高度保守的[9,11-12]。植物中，擬南芥Fe-S簇裝配機制的研究最為透徹[9,12]，果樹學中Fe-S簇裝配機制的研究較稀缺。葡萄中缺乏ADX2，僅含有ADX1，而ADX作為鐵氧還蛋白起到電子轉移體的作用，暗示葡萄ADX1可能功能獨特或者能夠獨當一面；此外，葡萄中含有更多數(shù)目的HSCA，揭示葡萄Fe-S簇裝配過程中需要更多的HSP70型伴侶蛋白[11-12]。但ISU和NFU家族基因均編碼Scaffold支架蛋白進而參與植物Fe-S簇裝配[9,11-14]，然而，本研究意外發(fā)現(xiàn)多年生木本果樹相較于一年生草本植物少了一些典型的支架蛋白，即ISU2、ISU3和NFU5丟失（表6），這些丟失的支架蛋白在本研究選定的木本果樹作物中肯定不是Fe-S簇裝配途徑所必需的。其他支架蛋白，包括SUFB、SUFC、SUFD、NFU1-4、ISU1、NBP35-1和 NBP35-2均存在，表明這10個基因在功能上對葡萄Fe-S簇裝配及鐵代謝途徑是足夠的。因此，推測高等植物Fe-S簇裝配機制可能經歷了復雜而長期的進化過程，特別是在線粒體 ISC裝配機制中，多年生木本植物更有可能進化出“非功能性”支架蛋白丟失的策略。

表6 9種高等植物ISU和NFU家族同源基因分析Table 6 Orthologs analysis of ISU and NFU members in 9 species of higher plants

基因表達模式分析結果表明葡萄 Fe-S簇裝配基因在葡萄不同年齡、不同部位組織材料中的表達量差異很大（圖3），且在幼苗不同部位對缺鐵脅迫轉錄水平的響應差異明顯，在幼苗根、莖、葉中均有 36個基因的表達水平受缺鐵處理調控：其中，根部Fe-S簇裝配基因的表達水平易受缺鐵脅迫誘導而上調，而地上部（莖和葉）Fe-S簇裝配基因的表達水平易受缺鐵脅迫抑制而下調（圖 4）。特別值得注意的是，ISU1在‘馬瑟蘭’葡萄組織中的表達量都是最豐富的，其次是HSCA1和ISA2，這一發(fā)現(xiàn)與水稻[17]和桃[19-20]中Fe-S簇裝配基因的表達特征較為相似，而與大豆[18]略有差異，大豆HSCA1表達量最高，其次是HSCA2；值得一提的是，ISU1、HSCA1和ISA2都屬于線粒體ISC機制的成員[9-12]，暗示線粒體ISC機制需要更多功能性的支架蛋白、伴侶蛋白和電子轉移體。

由于ISU1在‘馬瑟蘭’葡萄果實發(fā)育不同時期、葉片發(fā)育不同階段和幼苗組織中的表達量均最高（圖3），暗示ISU1是線粒體ISC裝配也是葡萄Fe-S簇裝配機制不可或缺的支架蛋白，在葡萄鐵代謝方面可能發(fā)揮關鍵作用。本研究所分析10種植物ISU1蛋白序列的一致性高達 77%，且具有多處高度保守的結構域區(qū)域（圖 5），這些發(fā)現(xiàn)暗示了遺傳距離較近的不同物種之間的 ISU1同源蛋白在長期的進化過程中可能具有相同或相近的功能。進一步的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明葡萄ISU1和番茄ISU1緊密聚集在一起（圖 6），而番茄作為典型的模式作物，研究其ISU1蛋白功能可能為揭示葡萄ISU1功能提供理論依據(jù)。

此外，本研究表明葡萄Fe-S簇裝配基因在‘馬瑟蘭’成年樹體與幼苗中的表達模式有所不同（圖3）。但SUFE2編碼葉綠體類SufE蛋白[9,12]，其在‘馬瑟蘭’葡萄組織材料中均未檢測到表達量，相比之下，SUFE1僅在‘馬瑟蘭’葡萄幼苗中檢測到表達量，而SUFE3在葡萄組織中廣泛表達，盡管表達水平相對較低（圖3），并且SUFE不同基因成員在轉錄水平對缺鐵脅迫的響應情況較為復雜，且差異明顯（圖4），這些結果表明同一基因家族不同成員之間的表達模式具有較強的組織特異性。已有研究表明，AtSUFE2表達具有花特異性，在擬南芥花粉中高量表達[20,24]。由此測，葡萄SUFE2可能也有類似特殊的功能，即參與葡萄花粉的發(fā)育，但需要進一步的后續(xù)功能驗證。CIA基因家族編碼WD40蛋白、DUF59功能域，在細胞質CIA裝配機制中發(fā)揮重要功能[11-14]，本研究中發(fā)現(xiàn)CIA1僅在‘馬瑟蘭’成年葡萄果實和葉片中檢測到表達量，CIA2在所有檢測組織中均沒有表達，而CIA3在所有檢測組織中的表達量較為均勻（圖 3），且僅有CIA1在幼苗根部受缺鐵脅迫強烈誘導外，CIA家族基因在不同組織中易受缺鐵脅迫抑制而降低（圖4），再次表明同一基因家族不同成員之間的表達模式具有較強的組織特異性，也暗示葡萄CIA基因功能的發(fā)揮依賴于適量的鐵素供應。此外，SUFB、SUFC、SUFD、NFU1-4、ISU1、NBP35-1和NBP35-2等支架蛋白編碼基因在‘馬瑟蘭’葡萄不同組織中的表達量較為適中，且易受缺鐵脅迫調控，再次暗示這10個基因直接參與葡萄Fe-S簇裝配機制。

4 結論

從葡萄中克隆并鑒定了46個Fe-S簇裝配基因，其在葡萄果實和葉片發(fā)育不同時期的表達水平差異很大，并在葡萄幼苗中對缺鐵脅迫在轉錄水平的響應差異顯著；ISU1在葡萄所有組織中的整體表達量較高，且葡萄ISU1和番茄ISU1之間的遺傳進化距離最為接近，推測ISU1在葡萄鐵代謝方面可能發(fā)揮關鍵作用。