楊 一，郝翊帆，李艾凝，王 佳，劉馨憶，王仁俊

(吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

作為糖尿病并發(fā)癥之一的糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)，處于持續(xù)高糖狀態(tài)時(shí)可使心臟功能代謝出現(xiàn)異常[1-2].眾所周知，全球糖尿病發(fā)病率逐年增加，伴隨的心血管疾病患者占糖尿病中死亡率和發(fā)病率的2/3以上[3].在DCM發(fā)展過(guò)程中，高糖和血脂異?？梢酝ㄟ^(guò)直接調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞中粘附分子，細(xì)胞因子及趨化因子分泌增加引起心肌產(chǎn)生低度慢性炎癥[4].炎癥反應(yīng)在DCM起著很大的作用，控制炎癥以及調(diào)控相關(guān)的炎癥通路或許能改善或者預(yù)防DCM發(fā)生.

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)作為茶多酚主要物質(zhì)，占其總量70%以上，具備多種生理活性[5].研究發(fā)現(xiàn)EGCG對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的抗炎效果顯著[6].EGCG可以改善心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、降低心肌細(xì)胞凋亡率、并調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用[7].本文通過(guò)研究大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)，進(jìn)行高糖誘導(dǎo)以及建立細(xì)胞損傷模型，研究EGCG預(yù)處理后改善心肌細(xì)胞損傷及其相關(guān)分子機(jī)制，以期為DCM預(yù)防提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料

H9C2(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，EGCG(上海生工)，SOD(WST-1法)和GSH-Px(比色法)試劑盒(南京建成公司)，TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(上海生工司).

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

將H9C2細(xì)胞于高糖(DMEM)培養(yǎng)基(添加10% FBS和1%雙抗)中培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱設(shè)置條件為37 ℃，5% CO2.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

分為3組：對(duì)照組、模型組(50 mmol/mL葡萄糖的高糖培養(yǎng)液處理)、藥物組(100 μg/mL劑量預(yù)處理1 h后用50 mmol/mL葡萄糖的高糖培養(yǎng)液處理).

1.2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)

將各處理組1×104cells/well細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h，然后采用MTT(四甲基偶氮唑鹽)方法檢測(cè)其存活率.

1.2.4 細(xì)胞SOD和GSH-Px測(cè)定

檢測(cè)方法遵從試劑盒操作步驟.

1.2.5 細(xì)胞炎性因子TNF-α和IL-6檢測(cè)

根據(jù)Mouse TNF-α和IL-6檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣本吸光度計(jì)算細(xì)胞因子表達(dá)量.

1.2.6 細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

提取RNA步驟遵從試劑盒說(shuō)明書(shū).樣品cDNA反轉(zhuǎn)錄操作步驟遵從cDNA試劑盒.目的基因引物序列見(jiàn)表1.采用qPCR檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB、IκBα以及IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平.

表1 目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析.*表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)H9C2心肌細(xì)胞活力的影響

如圖1表示各組H9C2心肌細(xì)胞活力.與正常組(99.85±2.60)相比，模型組(74.48±4.24)心肌細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組(84.83±2.90)H9C2細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.01).表明高糖誘導(dǎo)后的H9C2心肌細(xì)胞活力受EGCG保護(hù).

圖1 心肌細(xì)胞活力水平Fig.1 Myocardial cell viability level

2.2 EGCG對(duì)H9C2心肌細(xì)胞SOD及GSH-Px活性的影響

進(jìn)一步檢測(cè)了各處理組H9C2心肌細(xì)胞中抗氧化酶活性水平(SOD和GSH-Px)，結(jié)果如圖2所示.模型組H9C2細(xì)胞中SOD(165.84±7.42)和GSH-Px(440.03±14.54)活性與正常組(SOD：270.57±13.73；GSH-Px：555.33±17.54)相較明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組H9C2細(xì)胞中SOD(214.05±13.06)和GSH-Px(494.50±12.72)活性升高顯著(P<0.01).表明高糖誘導(dǎo)后的H9C2心肌細(xì)胞中抗氧化水平可被EGCG增強(qiáng).

圖2 細(xì)胞中SOD(A)和GSH-Px(B)酶活性水平Fig.2 SOD (A) and GSH PX (B) enzyme activity levels in cells

2.3 EGCG對(duì)H9C2心肌細(xì)胞中促炎因子(TNF-α和IL-6)水平的影響

通過(guò)ELISA檢測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞中TNF-α及IL-6抗體水平，結(jié)果如圖3所示.模型組H9C2細(xì)胞上清液中TNF-α(179.84±16.02)和IL-6(232.72±16.78)抗體表達(dá)水平與正常組(TNF-α：47.96±9.22；IL-6：85.75±11.69)相較增多明顯(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組H9C2細(xì)胞中TNF-α(126.66±8.90)和IL-6(166.09±16.73)抗體表達(dá)水平明顯下降(P<0.01).以上證明高糖誘導(dǎo)后的H9C2心肌細(xì)胞中促炎因子的表達(dá)量受EGCG抑制.

圖3 心肌細(xì)胞中促炎因子TNF-α(A)和IL-6(B)水平Fig.3 Proinflammatory factor TNF-α (A) And IL-6 (B) levels in cardiomyocytes

2.4 EGCG對(duì)H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)水平的作用

RT-PCR檢測(cè)各處理組H9C2心肌細(xì)胞中NF-κB、IκBα和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖4所示.模型組H9C2細(xì)胞中NF-κB(4.64±0.22)、IκBα(3.29±0.34)和IL-1β(2.60±0.17)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平同正常組相較上調(diào)明顯(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組心肌細(xì)胞中3個(gè)基因(NF-κB：3.10±0.27；IκBα：2.28±0.16；IL-1β：2.01±0.14)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P<0.01).表明H9C2心肌細(xì)胞被高糖誘導(dǎo)后胞內(nèi)NF-κB炎癥信號(hào)通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平可能被EGCG抑制.

圖4 心肌細(xì)胞中NF-κB、IκBα和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 NF-κB、IκBα and IL-1β mRNA transcription level in cardiomyocytes

3 結(jié)果與討論

DCM發(fā)病機(jī)制為高血糖誘導(dǎo)氧化自由基的生成，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8].所以治療糖尿病心肌病的重中之重是改善患者心肌狀況.在機(jī)體損傷過(guò)程中，NF-κB是一種多效的調(diào)節(jié)因子并廣泛存在真核生物細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路對(duì)多種炎癥反應(yīng)中炎性介質(zhì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，在多種急性損傷的病理機(jī)制中地位舉足輕重[9].NF-κB通路激活后可調(diào)控下游含有NF-κB結(jié)合序列的靶基因(如TNF-α、IL-1β、IκBα、IL-6等基因)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[10].EGCG作為茶多酚的主要成分之一，抗氧化和抗炎作用較好.EGCG抗炎機(jī)制可能是介導(dǎo)了抗氧化活性、抑制相關(guān)炎癥信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)等方面[11].作為強(qiáng)效的抗氧化劑，大量文獻(xiàn)研究已證實(shí)，EGCG對(duì)細(xì)胞損傷亦具有較強(qiáng)的抗炎作用，尤其是心肌細(xì)胞[6-7].A.M.EL-Mowafy等報(bào)道，EGCG還可借由減少白細(xì)胞數(shù)量、抑制氧化指標(biāo)活性、減輕全身炎癥，以減輕CP引起的心臟等臟器損傷[12].

本文采用EGCG對(duì)高糖誘導(dǎo)受損的大鼠心肌細(xì)胞損傷的改善作用及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了研究，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)給予EGCG后導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化酶活性增強(qiáng)，并能夠在一定程度上能夠抑制TNF-α、IL-6、NF-κB、IκBα和IL-1β的表達(dá)量，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞損傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)降低，其機(jī)制可能與激活NF-κB炎癥通路有關(guān)，EGCG通過(guò)抑制NF-κB易位入核，進(jìn)一步抑制TNF-α、IL-6等因子分泌，但具體分子機(jī)制還有待研究.

本研究表明EGCG可能通過(guò)NF-κB炎癥通路減輕高糖誘導(dǎo)后的H9C2心肌細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng).