楊 一，郝翊帆，李艾凝，王 佳，劉馨憶，王仁俊

(吉林師范大學 生命科學學院，吉林 四平 136000)

作為糖尿病并發(fā)癥之一的糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)，處于持續(xù)高糖狀態(tài)時可使心臟功能代謝出現異常[1-2].眾所周知，全球糖尿病發(fā)病率逐年增加，伴隨的心血管疾病患者占糖尿病中死亡率和發(fā)病率的2/3以上[3].在DCM發(fā)展過程中，高糖和血脂異?？梢酝ㄟ^直接調節(jié)心肌細胞內信號通路誘導細胞中粘附分子，細胞因子及趨化因子分泌增加引起心肌產生低度慢性炎癥[4].炎癥反應在DCM起著很大的作用，控制炎癥以及調控相關的炎癥通路或許能改善或者預防DCM發(fā)生.

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)作為茶多酚主要物質，占其總量70%以上，具備多種生理活性[5].研究發(fā)現EGCG對高糖誘導的心肌細胞損傷的抗炎效果顯著[6].EGCG可以改善心肌細胞的氧化應激、降低心肌細胞凋亡率、并調控凋亡相關蛋白表達水平發(fā)揮抗炎作用[7].本文通過研究大鼠心肌細胞(H9C2)，進行高糖誘導以及建立細胞損傷模型，研究EGCG預處理后改善心肌細胞損傷及其相關分子機制，以期為DCM預防提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料

H9C2(中國科學院上海細胞庫)，EGCG(上海生工)，SOD(WST-1法)和GSH-Px(比色法)試劑盒(南京建成公司)，TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(上海生工司).

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞培養(yǎng)

將H9C2細胞于高糖(DMEM)培養(yǎng)基(添加10% FBS和1%雙抗)中培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱設置條件為37 ℃，5% CO2.

1.2.2 實驗分組

分為3組：對照組、模型組(50 mmol/mL葡萄糖的高糖培養(yǎng)液處理)、藥物組(100 μg/mL劑量預處理1 h后用50 mmol/mL葡萄糖的高糖培養(yǎng)液處理).

1.2.3 細胞存活率檢測

將各處理組1×104cells/well細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h，然后采用MTT(四甲基偶氮唑鹽)方法檢測其存活率.

1.2.4 細胞SOD和GSH-Px測定

檢測方法遵從試劑盒操作步驟.

1.2.5 細胞炎性因子TNF-α和IL-6檢測

根據Mouse TNF-α和IL-6檢測試劑盒操作步驟進行，酶標儀在450 nm波長處檢測樣本吸光度計算細胞因子表達量.

1.2.6 細胞中mRNA轉錄水平檢測

提取RNA步驟遵從試劑盒說明書.樣品cDNA反轉錄操作步驟遵從cDNA試劑盒.目的基因引物序列見表1.采用qPCR檢測細胞中NF-κB、IκBα以及IL-1β mRNA轉錄水平.

表1 目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes

1.3 統(tǒng)計與分析

采用SPSS 20.0進行單因素方差分析.*表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 EGCG對H9C2心肌細胞活力的影響

如圖1表示各組H9C2心肌細胞活力.與正常組(99.85±2.60)相比，模型組(74.48±4.24)心肌細胞活力明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組(84.83±2.90)H9C2細胞活力顯著增強(P<0.01).表明高糖誘導后的H9C2心肌細胞活力受EGCG保護.

圖1 心肌細胞活力水平Fig.1 Myocardial cell viability level

2.2 EGCG對H9C2心肌細胞SOD及GSH-Px活性的影響

進一步檢測了各處理組H9C2心肌細胞中抗氧化酶活性水平(SOD和GSH-Px)，結果如圖2所示.模型組H9C2細胞中SOD(165.84±7.42)和GSH-Px(440.03±14.54)活性與正常組(SOD：270.57±13.73；GSH-Px：555.33±17.54)相較明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組H9C2細胞中SOD(214.05±13.06)和GSH-Px(494.50±12.72)活性升高顯著(P<0.01).表明高糖誘導后的H9C2心肌細胞中抗氧化水平可被EGCG增強.

圖2 細胞中SOD(A)和GSH-Px(B)酶活性水平Fig.2 SOD (A) and GSH PX (B) enzyme activity levels in cells

2.3 EGCG對H9C2心肌細胞中促炎因子(TNF-α和IL-6)水平的影響

通過ELISA檢測各組H9C2心肌細胞中TNF-α及IL-6抗體水平，結果如圖3所示.模型組H9C2細胞上清液中TNF-α(179.84±16.02)和IL-6(232.72±16.78)抗體表達水平與正常組(TNF-α：47.96±9.22；IL-6：85.75±11.69)相較增多明顯(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組H9C2細胞中TNF-α(126.66±8.90)和IL-6(166.09±16.73)抗體表達水平明顯下降(P<0.01).以上證明高糖誘導后的H9C2心肌細胞中促炎因子的表達量受EGCG抑制.

圖3 心肌細胞中促炎因子TNF-α(A)和IL-6(B)水平Fig.3 Proinflammatory factor TNF-α (A) And IL-6 (B) levels in cardiomyocytes

2.4 EGCG對H9C2心肌細胞內相關基因表達水平的作用

RT-PCR檢測各處理組H9C2心肌細胞中NF-κB、IκBα和IL-1β的mRNA轉錄水平，結果如圖4所示.模型組H9C2細胞中NF-κB(4.64±0.22)、IκBα(3.29±0.34)和IL-1β(2.60±0.17)的mRNA轉錄水平同正常組相較上調明顯(P<0.01)；與模型組相比，EGCG藥物組心肌細胞中3個基因(NF-κB：3.10±0.27；IκBα：2.28±0.16；IL-1β：2.01±0.14)的mRNA轉錄水平顯著下降(P<0.01).表明H9C2心肌細胞被高糖誘導后胞內NF-κB炎癥信號通路相關基因轉錄水平可能被EGCG抑制.

圖4 心肌細胞中NF-κB、IκBα和IL-1β的mRNA轉錄水平Fig.4 NF-κB、IκBα and IL-1β mRNA transcription level in cardiomyocytes

3 結果與討論

DCM發(fā)病機制為高血糖誘導氧化自由基的生成，促進細胞的凋亡，進而導致細胞死亡[8].所以治療糖尿病心肌病的重中之重是改善患者心肌狀況.在機體損傷過程中，NF-κB是一種多效的調節(jié)因子并廣泛存在真核生物細胞中，NF-κB信號通路對多種炎癥反應中炎性介質基因進行轉錄和調控，在多種急性損傷的病理機制中地位舉足輕重[9].NF-κB通路激活后可調控下游含有NF-κB結合序列的靶基因(如TNF-α、IL-1β、IκBα、IL-6等基因)的轉錄表達[10].EGCG作為茶多酚的主要成分之一，抗氧化和抗炎作用較好.EGCG抗炎機制可能是介導了抗氧化活性、抑制相關炎癥信號通路相關因子表達等方面[11].作為強效的抗氧化劑，大量文獻研究已證實，EGCG對細胞損傷亦具有較強的抗炎作用，尤其是心肌細胞[6-7].A.M.EL-Mowafy等報道，EGCG還可借由減少白細胞數量、抑制氧化指標活性、減輕全身炎癥，以減輕CP引起的心臟等臟器損傷[12].

本文采用EGCG對高糖誘導受損的大鼠心肌細胞損傷的改善作用及相關分子機制進行了研究，檢測發(fā)現給予EGCG后導致細胞抗氧化酶活性增強，并能夠在一定程度上能夠抑制TNF-α、IL-6、NF-κB、IκBα和IL-1β的表達量，高糖誘導的心肌細胞損傷減輕，細胞損傷過程中的炎癥反應降低，其機制可能與激活NF-κB炎癥通路有關，EGCG通過抑制NF-κB易位入核，進一步抑制TNF-α、IL-6等因子分泌，但具體分子機制還有待研究.

本研究表明EGCG可能通過NF-κB炎癥通路減輕高糖誘導后的H9C2心肌細胞損傷，抑制細胞炎癥反應.