宋海軍,楊族悌,劉軍,劉國磊

(1 南陽南石醫(yī)院麻醉科,河南 南陽 473000；2 河南省直第三人民醫(yī)院麻醉科)

星形膠質(zhì)細胞是廣泛分布于哺乳動物腦內(nèi)的一類非神經(jīng)元細胞，在腦缺血病理過程中發(fā)揮著保護和損傷神經(jīng)元的雙重作用[1-3]。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是細胞核內(nèi)一種高度保守的非組蛋白，可作為促炎因子和預警蛋白在先天性免疫應答、炎癥反應及細胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[4-6]。研究證實，HMGB1在腦缺血后大量升高，且可通過促進炎癥遞質(zhì)的釋放和調(diào)控星形膠質(zhì)細胞凋亡在腦缺血病理過程中發(fā)揮著重要作用[7]。丙泊酚是一種臨床手術(shù)過程中常見的靜脈麻醉藥，被證實可通過抑制細胞凋亡和炎癥遞質(zhì)的釋放在腦損傷過程中發(fā)揮保護作用[8-9]。近年研究顯示，丙泊酚可通過抑制小膠質(zhì)細胞HMGB1的表達調(diào)控腦損傷免疫炎癥系統(tǒng)[10]，但HMGB1在丙泊酚保護腦缺血誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷中的作用并不清楚。腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞糖氧剝奪再灌注模型是研究體內(nèi)腦缺血常用的細胞模型[11]，本研究從細胞凋亡和炎癥反應角度出發(fā)，首次探討HMGB1在丙泊酚保護糖氧剝奪再灌注誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷中的作用，以期為闡明丙泊酚保護腦損傷的分子機制提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級新生Wistar大鼠(體質(zhì)量12～15 g)購于山東省實驗動物中心。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液和DMEM無糖培養(yǎng)液購于美國Gibco公司。丙泊酚購于美國Sigma公司。兔抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體和β-肌動蛋白(β-actin)抗體均購于美國CST公司，兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved caspase-3)抗體和HMGB1抗體購于美國Abcam公司。噻唑藍(MTT)試劑和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白檢測試劑盒購于美國Pierce公司。細胞凋亡檢測試劑盒、ECL試劑盒及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和HMGB1的ELISA試劑盒購于上海碧云天公司。pcDNA3.1-HMGB1過表達載體質(zhì)粒購于BioVector質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組與處理 將新生大鼠處死分離出大腦皮質(zhì)后，剝離腦膜和血管等結(jié)構(gòu)，將獲得的星形膠質(zhì)細胞參照文獻方法[12]檢測純化培養(yǎng)后以每孔3×105個細胞種植于96孔細胞板上。實驗分為5組，分別為對照組(A組)、模型組(B組)、模型+丙泊酚組(C組)、模型+丙泊酚+空載體組(D組)和模型+丙泊酚+HMGB1組(E組)。其中后4組行糖氧剝奪再灌注處理：棄原培養(yǎng)液后，加入無糖DMEM培養(yǎng)液，放入低氧(含體積分數(shù)0.02的O2)培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)6 h(即糖氧剝奪處理)；后3組給藥處理：加入含10 μmol/L丙泊酚的無糖DMEM培養(yǎng)液。糖氧剝奪處理6 h后，從低氧培養(yǎng)箱中取出并棄無糖培養(yǎng)液，加入含10 μmol/L丙泊酚的含糖培養(yǎng)液并培養(yǎng)24 h，置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h(即再灌注處理)。模型+丙泊酚+空載體組：在糖氧剝奪處理前，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟加入pcDNA3.1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。模型+丙泊酚+HMGB1組：在糖氧剝奪處理前，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟加入pcDNA3.1-HMGB1過表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGB1過表達載體質(zhì)粒的陰性對照，以排除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對實驗結(jié)果的干擾。

1.2.2MTT法檢測細胞存活率 收集處理結(jié)束后的各組細胞，按照每孔105個細胞密度種植于96孔細胞板上，置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL孵育4 h。再以200 μL二甲基亞砜孵育20 min使藍紫色結(jié)晶完全溶解。使用酶標儀檢測各組細胞在490 nm波長處的吸光度(A)值。細胞存活率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A組)×100%。實驗重復3次。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集處理結(jié)束后的各組細胞，參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.4ELISA法檢測細胞上清液中HMGB1、IL-6和TNF-α含量 收集處理結(jié)束后的各組細胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測細胞上清液中HMGB1、IL-6和TNF-α含量。實驗重復3次。

1.2.5比色法檢測細胞LDH漏出率 收集各組細胞培養(yǎng)液，根據(jù)LDH試劑盒說明書步驟分別檢測培養(yǎng)液和細胞內(nèi)的LDH活性。LDH漏出率=培養(yǎng)液中LDH活性/(細胞內(nèi)LDH活性+培養(yǎng)液中LDH活性)×100%。實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測細胞中HMGB1、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達 在冰上向收集到的各組細胞中加入RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，以BCA定量法檢測蛋白的濃度。在SDS-RIPA凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜置于含50 g/L脫脂奶粉的TBST液中處理1 h后，加入使用TBST稀釋的HMGB1抗體(1∶1 000)、Bax抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、Cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000)于4 ℃下結(jié)合反應24 h，再以TBST稀釋的二抗(1∶2 000，辣根過氧化酶標記)室溫孵育1.5 h。蛋白條帶在Quantity One軟件中進行半定量分析，以β-actin為內(nèi)參照。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞中的HMGB1蛋白表達和上清液中HMGB1、IL-1β及TNF-α含量比較

與對照組相比，模型組細胞內(nèi)HMGB1蛋白表達水平和細胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量均顯著升高(F=171.199～391.008，q=28.058～49.269，P均<0.01)；與模型組相比，模型+丙泊酚組細胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達水平以及HMGB1、IL-1β和TNF-α的含量均顯著降低(q=22.531～35.032，P<0.01)；與模型+丙泊酚組比較，模型+丙泊酚+HMGB1組細胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達水平以及HMGB1、IL-1β和TNF-α的含量均顯著升高(q=14.811～23.987，P均<0.01)，而模型+丙泊酚+空載體組中則沒有見顯著改變(P>0.05)。見圖1和表1。

A：對照組，B：模型組，C：模型+丙泊酚組，D：模型+丙泊酚+空載體組，E：模型+丙泊酚+HMGB1組。

表1 各組細胞HMGB1蛋白表達及上清液HMGB1、IL-1β和TNF-α含量比較

2.2 各組細胞存活率和LDH漏出率的比較

與對照組相比，模型組細胞存活率顯著降低，而LDH漏出率顯著升高(F=167.790、349.324，q=33.505、47.940，P均<0.01)；與模型組相比，模型+丙泊酚組細胞存活率顯著升高，而LDH漏出率顯著降低(q=21.751、24.714，P均<0.01)；與模型+丙泊酚組相比較，模型+丙泊酚+空載體組細胞存活率和LDH漏出率均未見顯著改變(P>0.05)，但模型+丙泊酚+HMGB1組細胞存活率顯著降低，而LDH漏出率顯著升高(q=13.038、17.792，P<0.01)。見表2。

表2 各組細胞存活率和LDH漏出率的比較

2.3 各組細胞凋亡率的比較

對照組、模型組、模型+丙泊酚組、模型+丙泊酚+空載體組和模型+丙泊酚+HMGB1組的細胞凋亡率分別為(2.16±1.02)%、(32.25±2.36)%、(13.58±1.12)%、(12.16±1.05)%和(23.85±1.37)%，多組間比較差異有顯著性(F=184.887，P<0.05)。與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高(q=35.390，P<0.05)；與模型組比較，模型+丙泊酚組細胞凋亡率顯著降低(q=21.958，P<0.05)；與模型+丙泊酚組相比較，模型+丙泊酚+HMGB1組凋亡率顯著升高(q=12.079，P<0.05)，而模型+丙泊酚+空載體組凋亡率未見顯著改變(P>0.05)。見圖2。

A：對照組，B：模型組，C：模型+丙泊酚組，D：模型+丙泊酚+空載體組，E：模型+丙泊酚+HMGB1組。

2.4 各組細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的比較

與對照組相比，模型組細胞Bcl-2蛋白表達水平降低，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高(F=81.619～165.223，q=24.398～33.331，P均<0.05)；與模型組相比，模型+丙泊酚組Bcl-2蛋白表達升高，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著降低(q=11.711～18.974，P均<0.05)；與模型+丙泊酚組相比，模型+丙泊酚+HMGB1組細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高(q=5.885～13.703，P均<0.01)；但是，模型+丙泊酚+空載體組與模型+丙泊酚組相比較，細胞Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達水平差異無顯著性(P>0.05)。見圖3和表3。

A：對照組，B：模型組，C：模型+丙泊酚組，D：模型+丙泊酚+空載體組，E：模型+丙泊酚+HMGB1組。

表3 各組細胞Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達比較

3 討 論

HMGB1通常位于細胞核內(nèi)，可被主動或被動釋放到胞外，而胞外的HMGB1可通過與許多因子或受體作用，影響核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活性，進而在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應、細胞增殖和細胞凋亡等過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[13]。HMGB1可加重缺血損傷，而靶向抑制HMGB1被認為是臨床預防腦缺血損傷的重要策略[14-15]。本研究在構(gòu)建的糖氧剝奪再灌注損傷星形膠質(zhì)細胞模型中顯示，HMGB1表達升高；同時，促炎因子IL-1β和TNF-α表達升高，星形膠質(zhì)細胞存活率降低，凋亡率升高，促凋亡蛋白Bax和凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低。李滿等[12]研究指出，糖氧剝奪/復氧后釋放的HMGB1可通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達促進星形膠質(zhì)細胞損傷和凋亡。本研究結(jié)果與其類似，提示HMGB1在糖氧剝奪再灌注損傷的星形膠質(zhì)細胞炎癥反應和細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。

丙泊酚在抗炎和保護腦組織損傷方面發(fā)揮著重要作用[16-17]。劉波等[18]研究顯示，低劑量的丙泊酚可通過抑制炎癥反應改善腦缺血再灌注損傷。顧新宇等[19]研究證實，丙泊酚可激活ERK信號通路提高原代海馬星形膠質(zhì)細胞的細胞活力，在丙泊酚鎮(zhèn)靜過程中維持腦穩(wěn)態(tài)。陸瑜等[20]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過抑制miR-181a并增強抑凋亡蛋白Bcl-2的表達對乏糖培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞發(fā)揮保護作用。本研究結(jié)果也表明，丙泊酚對糖氧剝奪再灌注誘導的星形膠質(zhì)細胞的活性降低、炎癥反應加重和細胞凋亡能力增強等現(xiàn)象均有明顯改善作用。同時，丙泊酚還可引起HMGB1表達降低。而WANG等[21]研究表明，丙泊酚可通過抑制脂多糖誘導的HMGB1表達和釋放在膿毒癥病人中起保護作用。張明曉等[10]研究證實，丙泊酚可通過激活p38 MAPK信號通路抑制TNF-α誘導小膠質(zhì)細胞HMGB1表達，影響腦損傷晚期炎癥反應。提示HMGB1在丙泊酚保護糖氧剝奪再灌注誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷過程中發(fā)揮著重要作用。為了證實這一推測，本研究通過上調(diào)HMGB1蛋白的表達顯示，丙泊酚對糖氧剝奪再灌注誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷的保護作用明顯逆轉(zhuǎn)。說明丙泊酚可能通過下調(diào)HMGB1發(fā)揮保護糖氧剝奪再灌注誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷。

綜上所述，丙泊酚可以通過抑制星形膠質(zhì)細胞的凋亡和炎癥反應改善糖氧剝奪再灌注損傷，而HMGB1表達下調(diào)是該保護過程的重要機制。該結(jié)果進一步豐富了丙泊酚保護腦缺血損傷的分子機制，但丙泊酚是如何從通路分子水平抑制HMGB1表達還有待進一步深入研究。