溫新麗,賀玉偉,薛曉梅,吳欣,賈兆通

(青島大學(xué),山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科；2 附屬醫(yī)院山東省代謝性疾病重點實驗室；3 代謝病研究院)

近年來痛風(fēng)已經(jīng)成為繼糖尿病之后的第二大代謝系統(tǒng)疾病[1]。相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，痛風(fēng)病人已超過8 000萬人，而且病人人數(shù)以9.7%的年增長率增加[2]。痛風(fēng)的病理特征是尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)和組織中，進而觸發(fā)免疫細胞引發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。其主要危險因素是高尿酸血癥，即血清尿酸鹽水平升高。對于大多數(shù)痛風(fēng)病人來說，排泄不足是高尿酸血癥的主要原因[4]。痛風(fēng)如得不到及時有效的治療可能累及腎臟，導(dǎo)致痛風(fēng)性腎病，嚴重者出現(xiàn)腎功能不全等[5]。目前西醫(yī)治療可產(chǎn)生諸多副作用，如胃腸道反應(yīng)、皮疹、肝腎功能損傷等。此外，此類藥物不能預(yù)防、阻止或逆轉(zhuǎn)痛風(fēng)的進程。中藥復(fù)方和從中草藥分離出的某些化合物已被用于治療痛風(fēng)，效果令人滿意[6]，并且不良反應(yīng)低于西藥[7]。痛風(fēng)湯是以土茯苓、萆薢、蒼術(shù)、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花組合形成基礎(chǔ)方，病人合并不同痛風(fēng)癥狀時加減不同藥材以控制癥狀[8]。痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)效果良好，無顯著毒副作用，復(fù)發(fā)率低[9]。目前尚無系統(tǒng)研究痛風(fēng)湯物質(zhì)基礎(chǔ)及其治療痛風(fēng)機制的報道。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示痛風(fēng)湯活性成分和關(guān)鍵靶點，以探討其治療痛風(fēng)的機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 痛風(fēng)湯活性成分和對應(yīng)靶點的獲取

分別以“威靈仙”、“蒼術(shù)”、“薏苡仁”、“澤瀉”、“桃仁”、“紅花”、“土茯苓”、“粉萆薢”、“蠶沙”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php)[10]中，檢索獲得其化學(xué)成分；在檢索結(jié)果中限定口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為條件進行篩選。同時在中國中藥整合數(shù)據(jù)庫(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid)[11]平臺中以“地龍”為關(guān)鍵詞，檢索獲得其化學(xué)成分“蚯蚓素”?！膀球舅亍钡南鄳?yīng)靶點通過Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫(SEA，http://sea.bkslab.org)[12]進行預(yù)測。使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建痛風(fēng)湯的“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 痛風(fēng)相關(guān)靶點基因的獲取

在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(Genecards，https://www.genecards.org)中以“gout”為關(guān)鍵詞檢索與痛風(fēng)相關(guān)的靶點基因。

1.3 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

所有的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)均來自STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)的分析結(jié)果。首先將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建痛風(fēng)湯靶點之間的PPI網(wǎng)絡(luò)、痛風(fēng)相關(guān)靶點之間的PPI網(wǎng)絡(luò)、痛風(fēng)湯和痛風(fēng)共同涉及的關(guān)鍵通路的PPI網(wǎng)絡(luò)。然后用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)預(yù)測痛風(fēng)湯某些成分的真實靶點。

1.4 KEGG信號通路富集分析

將痛風(fēng)湯靶點和痛風(fēng)相關(guān)靶點的基因名導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[13]進行KEGG信號通路富集分析，保存結(jié)果。選取滿足FDR<0.05的通路，并根據(jù) FDR值的大小繪制氣泡圖。

1.5 分子對接

應(yīng)用SwissDock(http://www.swissdock.ch)將FLT3(PDB ID:4rt7)、MAOA(PDB ID:2Z5X)分別與槲皮素、木犀草素進行分子對接；選取NOS2(PDB ID:4NOS)、PTGS2(PDB ID:5ikq)與漢黃芩素進行分子對接。對接結(jié)果通過PyMOL 1.7.0(美國Schr?dinger,LLC)展示。

2 結(jié) 果

2.1 痛風(fēng)湯“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

共從痛風(fēng)湯10味藥材中篩選出痛風(fēng)湯活性成分82個，活性成分對應(yīng)的靶點244個。通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建的痛風(fēng)湯“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)見圖1。

綠色節(jié)點()代表痛風(fēng)湯的10味藥材；藍色節(jié)點()代表痛風(fēng)湯中的活性成分；紅色節(jié)點()代表痛風(fēng)湯活性成分對應(yīng)的靶點。

2.2 痛風(fēng)湯作用靶點和痛風(fēng)相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

將痛風(fēng)湯作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，獲取其PPI網(wǎng)絡(luò)的原始數(shù)據(jù)并保存，使用Cytoscape 3.7.1繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。剔除未與網(wǎng)絡(luò)連接的3個作用靶點，此網(wǎng)絡(luò)共包含了241個節(jié)點(圖2A)。靶點與靶點的連接度越高，重要性越強，顏色越趨向于紅色，且靶點的面積較大。因此，痛風(fēng)湯靶點中連接度最高的5個靶點分別為AKT1、ALB、IL-6、TP53和MAPK-3。對978個痛風(fēng)相關(guān)靶點進行分析，獲得了痛風(fēng)相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2B)。該網(wǎng)絡(luò)減去未結(jié)合的180個作用靶點，共包含798個痛風(fēng)相關(guān)靶點基因。痛風(fēng)相關(guān)靶點中連接度最高的5個靶點分別為IL-6、INS、GAPDH、TNF和ALB。

A：痛風(fēng)湯作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)；B：痛風(fēng)相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。靶點與靶點的連接度越高，重要性越強，顏色越趨向于紅色，且靶點的面積較大。

2.3 痛風(fēng)湯和痛風(fēng)涉及的細胞信號通路

通過KEGG通路富集分析找到痛風(fēng)湯涉及的26個重要信號通路(圖3A)和痛風(fēng)發(fā)病涉及的14個細胞信號通路(圖3B)。痛風(fēng)湯靶點通路與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)通路相互重疊的共同通路為4個，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。由于KEGG分析中Pathway in cancer的-Log10FDR值最大，因此Pathway in cancer對于痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)的機制是最重要的。

A：痛風(fēng)湯涉及的26個重要信號通路；B:痛風(fēng)發(fā)病涉及的14個細胞信號通路。

2.4 痛風(fēng)湯與痛風(fēng)涉及共同細胞信號通路的PPI網(wǎng)絡(luò)

從Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway共4個細胞信號通路中找到痛風(fēng)湯和痛風(fēng)均涉及的靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，找到各PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(圖4)。Cytoscape分析中，靶點顏色越趨向紅色，且靶點面積越大，即被認為關(guān)鍵程度越高。因此，Pathway in cancer通路中涉及的排名前5位的最關(guān)鍵靶點分別為TP53、PTGS2、IL6、MAPK1和RELA。

靶點顏色越趨向紅色，且靶點面積越大，關(guān)鍵程度越高。

2.5 TP53及其對應(yīng)藥物活性成分真實靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

痛風(fēng)湯中對應(yīng)TP53靶點的活性成分是土茯苓和紅花中的槲皮素(Quercetin)、紅花中的木犀草素(Luteolin)和蒼術(shù)中的漢黃芩素(Wogonin)。通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測到槲皮素的59個預(yù)測靶點、木犀草素的25個預(yù)測靶點和漢黃芩素的2個預(yù)測靶點。分別利用這些化合物的真實靶點構(gòu)建了與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖5)，顯示出槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等痛風(fēng)湯活性成分調(diào)控TP53基因的機制。

A:木犀草素真實靶點與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)；B:漢黃芩素真實靶點與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)；C:槲皮素真實靶點與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.6 分子對接

選取FLT3、MAOA分別與木犀草素、槲皮素進行分子對接，選取NOS2、PTGS2與漢黃芩素進行了分子對接，揭示了痛風(fēng)湯的特定活性成分與其靶點的結(jié)合模式(圖6)。

圖6 分子對接結(jié)果

3 討 論

痛風(fēng)的臨床特點為高尿酸血癥及其引發(fā)的急性炎癥[14]。中醫(yī)學(xué)認為高尿酸血癥是因濕濁、熱毒、血瘀、痰凝所致，需以祛濕通絡(luò)、泄?jié)峤舛緸橹委熢瓌t[15]。國醫(yī)大師朱良春認為濕濁瘀滯內(nèi)阻，才是痛風(fēng)發(fā)病的主要原因，并將其命名為“濁瘀痹”[16]。痛風(fēng)湯是治療“濁瘀痹”的專病專方。因此有必要深入研究其組方規(guī)律和作用機制。

痛風(fēng)湯的基礎(chǔ)方(土茯苓、萆薢、蒼術(shù)、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花)可促進濁毒泄化、瘀結(jié)解除。在此基礎(chǔ)上可加入其他藥材，做到辨證論治，個體化給藥[8]。由于中藥復(fù)方具有藥效的整體性和成分的復(fù)雜性，揭示復(fù)方中有效成分與靶點、信號途徑之間的關(guān)系，是研究中藥復(fù)方的關(guān)鍵[17]。同樣，深入理解痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)的作用需要一種揭示成分-靶點-通路關(guān)系的系統(tǒng)生物學(xué)方法。中藥復(fù)方的藥理作用可能是由于多種成分作用于多個靶點，進而調(diào)控多個細胞信號途徑的過程。系統(tǒng)生物學(xué)中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也許能解決中藥作用機制復(fù)雜性的問題。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的目的不是確定單個候選化合物，而是全面分析復(fù)雜體系，構(gòu)建復(fù)雜成分與其藥理學(xué)作用之間的網(wǎng)絡(luò)[18]，其整體和系統(tǒng)特征與中藥發(fā)揮作用的原理一致。

本研究中KEGG分析結(jié)果顯示，痛風(fēng)湯的藥理作用涉及27個信號通路，而與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵通路共有14個。痛風(fēng)湯藥理作用與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)通路均涉及的共同通路為4個，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。這樣的思路與大部分中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究不同。細胞信號通路包含了多種靶點，而且每個靶點被不同的化合物所影響。但是，每個信號通路所代表的生物學(xué)效應(yīng)是固定的，這樣的生物學(xué)效應(yīng)不會因為不同化合物靶向于通路中不同的靶點而發(fā)生改變。因此，不同化合物作用于不同的蛋白靶點時，很可能具有相同的生物學(xué)效應(yīng)。只要這些蛋白靶點涉及同一信號通路即可。因此，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究過程中，可以預(yù)先忽略中藥復(fù)方的靶點與疾病相關(guān)靶點中共同靶點，分別尋找相關(guān)靶信號通路，進而得到共同信號通路。這可能是中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的改進。

本文研究結(jié)果還顯示，痛風(fēng)湯涉及的最重要通路是Pathways in cancer，其中TP53為關(guān)鍵靶點?？捎绊慣P53的化合物分別是土茯苓和紅花中的槲皮素、紅花中的木犀草素、蒼術(shù)中的漢黃芩素。槲皮素是日常飲食中含量最豐富的類黃酮之一，它可抑制黃嘌呤氧化酶(XOD)催化的尿酸和超氧自由基的生成，可以作為預(yù)防痛風(fēng)和過氧化損傷的潛在化合物[19]。木犀草素是芹菜和青椒的主要成分之一，可競爭性地抑制XOD[20]。在高尿酸血癥小鼠中，槲皮素與木犀草素的這種作用有助于增強尿酸排泄并改善高尿酸血癥引起的腎功能不全。此外，還有研究顯示，木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷還可減輕單鈉尿酸鹽晶體引起的小鼠足腫脹和炎癥，其機制可能與它們降低IL-1β和TNF-α的水平有關(guān)[21]。漢黃芩素對XOD也有較強的抑制作用[22]，其IC50=157.38 μmol/L[23]。因此有研究指出，漢黃芩素可能是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在化合物[24]。

該研究也存在一些網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究存在的共性問題。例如本研究中使用的痛風(fēng)湯活性成分來自TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選標準則是根據(jù)化合物的OB和DL的大小來決定是否候選為活性成分。但是本研究中動物藥材地龍的唯一候選成分蚯蚓素，來自TCMID數(shù)據(jù)庫，沒有按照OB和DL的標準來篩選。因此，在今后的研究中需要統(tǒng)一篩選標準，且需要更多來自地龍的候選成分。另外在研究過程中還發(fā)現(xiàn)，許多文獻報道的活性化合物未達到數(shù)據(jù)庫的OB和DL大小標準而被從活性成分的列表中剔除。在今后的研究中需要對這部分化合物進行重新評價，納入活性成分列表進行深入發(fā)掘。未來在解決以上共性問題的基礎(chǔ)上，需要在細胞水平驗證活性成分-靶點、成分-通路的關(guān)系，這樣才能驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的準確性，這對于闡明痛風(fēng)湯作用機制、篩選其中的活性成分具有重要意義。