何錫忠，林 鷙，趙本進，朱永軍，彭麗英

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)按照細(xì)胞的貼壁性質(zhì)可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和貼壁細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)[1]。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)不適合在普通搖瓶中進行，且存在微載體價格昂貴、重復(fù)利用效果差、細(xì)胞制備需求量過大等缺點。全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)具有細(xì)胞密度大、放大倍數(shù)大、傳代方便等優(yōu)勢，但對各種培養(yǎng)條件也有較高要求。無血清培養(yǎng)是用已知的人源或者動物源蛋白或生長因子、激素來代替動物血清的一種培養(yǎng)方式，可降低后期純化工作難度，提高產(chǎn)品質(zhì)量[2]。馴化一株可適應(yīng)普通搖瓶的全懸浮細(xì)胞可推進細(xì)胞培養(yǎng)工藝的進一步升級。全懸浮細(xì)胞馴化技術(shù)已在一些細(xì)胞中得到廣泛應(yīng)用。阿爾祖古麗·阿依丁等[3]對Marc-145 P50 代細(xì)胞進行無血清懸浮培養(yǎng)48 h 后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度可達(dá)到4.14×106cells/mL；劉天倫等[4]使用3 種培養(yǎng)方法馴化，將PK15 細(xì)胞從復(fù)蘇到最終馴化成全懸浮細(xì)胞，傳代23 個代次，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)良好；王嘉琪等[5]通過梯次降低血清添加量，逐步多代次適應(yīng)，使ST 細(xì)胞由貼壁轉(zhuǎn)為懸浮，并能在無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定傳代，在反應(yīng)器中高密度懸浮生長。本研究對一株貼壁ST 細(xì)胞在只通過1 個低血清滴度添加量適應(yīng)培養(yǎng)后，進行無血清全懸浮馴化，并對豬偽狂犬病毒（PRV）在ST 懸浮細(xì)胞上的敏感性進行分析，以期為大規(guī)模培養(yǎng)PRV、豬傳染性胃腸炎病毒、豬細(xì)小病毒和豬瘟病毒等提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 ST 細(xì)胞株，購自湖南豐暉生物科技有限公司；PRV sx-gE 毒株，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所課題組保存。

1.1.2 試劑及耗材 新生牛血清（NBS）、胰酶、DMEM，購自GIBCO 公司；ST-A 低血清培養(yǎng)基、ST-S 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，購自上海源培生物科技股份有限公司；T-75 細(xì)胞瓶、125 mL Erlenmeyer Flask 搖瓶，購自CORNING 公司；無血清細(xì)胞凍存液，購自新賽美生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 軌道式振蕩器，購自杭州奧盛儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，為Thermo 公司產(chǎn)品；Retiga2000R 高敏感度冷熒光數(shù)碼顯微鏡，為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 ST 貼壁細(xì)胞低濃度血清適應(yīng)馴化

當(dāng)貼壁培養(yǎng)的ST 細(xì)胞在含有10% NBS 的DMEM 培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長至匯合率達(dá)80%左右時，棄去培養(yǎng)液，加入適量PBS 溶液洗滌3 遍；加入適量胰酶，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用片刻后棄掉胰酶消化液，37 ℃孵育，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓縮后輕拍瓶底解離細(xì)胞；加入5 mL ST-A 低血清培養(yǎng)基（含1% NBS）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞移植至T-75細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)；當(dāng)ST 細(xì)胞匯合率達(dá)80%左右時，以低血清培養(yǎng)基（含1% NBS）連續(xù)傳兩代。

1.3 ST 細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)

將適應(yīng)了ST-A低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的ST細(xì)胞，移植至125 mL 搖瓶中進行懸浮培養(yǎng)馴化；將搖瓶安置在振蕩器（轉(zhuǎn)速設(shè)置為130 r/min）上，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行懸浮傳代培養(yǎng)。

1.3.1 ST 細(xì)胞無血清全懸浮馴化 將在細(xì)胞瓶中低血清培養(yǎng)的ST 貼壁細(xì)胞用胰酶消化，以10 mL ST-S 無血清培養(yǎng)基重懸，1 000 r/min 離心5 min；棄上清，再用5 mL ST-S 無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)細(xì)胞密度；將細(xì)胞密度稀釋至1.00×106cells/mL，然后接種至帶通氣蓋的125 mL 搖瓶內(nèi)震蕩培養(yǎng)，每24 h 取樣計算細(xì)胞密度和活率。

1.3.2 馴化ST 細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)傳代 在馴化的ST 細(xì)胞密度達(dá)到3.00×106cells/mL 以上或者已懸浮培養(yǎng)48 h 時，以1.00×106cells/mL 的細(xì)胞密度進行細(xì)胞傳代。當(dāng)連續(xù)傳代3 代以上，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)48 h 均能到達(dá)3.00×106cells/mL 以上，且細(xì)胞活率不低于90%，則判定細(xì)胞適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)。

1.3.3 ST 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)連續(xù)傳代 取適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)的第5 代ST 細(xì)胞，以細(xì)胞密度1.00×106cells/mL進行連續(xù)傳代，觀察第10、15、20、25 代次細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后的生長情況。

1.4 ST 懸浮細(xì)胞保存和復(fù)蘇

1.4.1 ST 懸浮細(xì)胞保存 將懸浮培養(yǎng)的第5 代ST 細(xì)胞按照常規(guī)方法收集于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去離心管中的上清液，收集細(xì)胞沉淀；加入適量無血清細(xì)胞凍存液于離心管中，使細(xì)胞終密度在2.00×107cells/mL 以上?；靹蚣?xì)胞后，制成細(xì)胞混合液并均勻分裝于凍存管中，每管1 mL，做好標(biāo)記；直接將分裝好的細(xì)胞凍存管置于-80 ℃超低溫冰箱長期冷凍保存，進行細(xì)胞穩(wěn)定性傳代驗證。

1.4.2 ST 懸浮細(xì)胞復(fù)蘇 將冷凍保存2 周后的第5 代細(xì)胞凍存管從-80 ℃超低溫冰箱取出，40 ℃水浴解凍；常溫下1 000 r/min 離心5 min，去除上清后用適量ST-S 無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)細(xì)胞密度；將細(xì)胞稀釋至初始密度為1.00×106cells/mL，然后接種至搖瓶內(nèi)震蕩培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況。

1.5 ST 懸浮細(xì)胞接毒試驗

取適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的第10 代ST 細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至2.00×106cells/mL，將搖瓶安置在振蕩器（轉(zhuǎn)速設(shè)置為130 r/min）上，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)；然后將PRV sx-gE 毒株病毒液按照感染復(fù)數(shù)為1.0（MOI=1）的量加至搖瓶內(nèi)，震蕩培養(yǎng)72 h 并收獲病毒液；將病毒液反復(fù)凍融3 次后，接種至同樣密度的ST 懸浮細(xì)胞中繼續(xù)盲傳培養(yǎng)，如此反復(fù)接毒培養(yǎng)并收獲。當(dāng)連續(xù)傳代3代以上，且毒價在72 h能達(dá)到9.0 TCID50/mL時，判定此PRV sx-gE 毒株適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞密度和TCID50 測定

本研究中的細(xì)胞密度測定是在取樣后立即開展細(xì)胞計數(shù)，具體為用含10 g/L 結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，以血細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞計數(shù)，其中細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)÷（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。TCID50測定按照常規(guī)方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 ST 貼壁細(xì)胞低濃度血清培養(yǎng)情況

由表1 可知，兩次細(xì)胞傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合率在80%時，ST 細(xì)胞可擴增至2.00×106cells/mL及以上，表明ST 貼壁細(xì)胞能適應(yīng)ST-A 低血清培養(yǎng)基（含1% NBS）培養(yǎng)。

表1 ST 貼壁細(xì)胞低血清培養(yǎng)密度情況

2.2 ST 細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)馴化

結(jié)果（表2）顯示，在初始接種密度1.00×106cells/mL，培養(yǎng)48 h 后，自傳至第3 代起，ST 細(xì)胞最終培養(yǎng)密度能達(dá)到3.00×106cells/mL 及以上，比第1 代和第2 代都高，且細(xì)胞活率高于90%，表明此細(xì)胞基本適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)。

表2 ST 細(xì)胞懸浮無血清的馴化密度情況

2.3 ST 懸浮細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)

結(jié)果（圖1）顯示，以細(xì)胞密度1.00×106cells/mL 進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，第10、15、20、25代次細(xì)胞分別懸浮培養(yǎng)48 h 后，最終細(xì)胞密度均可達(dá)4.20×106cells/mL 以上，高于3.00×106cells/mL的判定標(biāo)準(zhǔn)，且每代細(xì)胞密度值及活率較穩(wěn)定，表明此ST 懸浮細(xì)胞株可以連續(xù)傳代培養(yǎng)。

2.4 復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇凍存的第5 代細(xì)胞進行懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ST 細(xì)胞生長穩(wěn)定，培養(yǎng)48 h 后最終細(xì)胞密度可達(dá)4.50×106cells/mL；之后，隨著培養(yǎng)時間增加細(xì)胞活率有所降低（表3）。在顯微鏡下觀察復(fù)蘇后懸浮培養(yǎng)24、48、72、96 h 的細(xì)胞形態(tài)，可發(fā)現(xiàn)ST細(xì)胞輪廓清晰、分散均勻、大小均一性良好（圖2）

表3 復(fù)蘇細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)情況

2.5 PRV 在ST 懸浮細(xì)胞中的增殖

如表4所示：2.00×106cells/mLST懸浮細(xì)胞接種PRV sx-gE 毒株后，PRV 毒價隨著盲傳代次增加逐步提高，培養(yǎng)至第5 代時毒價達(dá)到109.0TCID50/mL，且繼續(xù)接種培養(yǎng)至第7 代，病毒毒價均為109.00TCID50/mL 及以上，初步表明PRV sx-gE 毒株可在ST 懸浮細(xì)胞中培養(yǎng)增殖。

表4 不同代次PRV 在ST 懸浮細(xì)胞中增殖能力比較

3 討論

細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究主要是評估細(xì)胞在連續(xù)傳代后其生長特性是否發(fā)生改變，這也是評估細(xì)胞可否應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)的重要的、必不可少的部分[6]。本試驗結(jié)果顯示，連續(xù)傳代培養(yǎng)25 代次，每隔5 代次懸浮培養(yǎng)48 h 測得最終細(xì)胞密度均達(dá)到4.20×106cells/mL 以上，并保持較高的活率，與陳宏等[7]研究結(jié)果相似。

細(xì)胞在培養(yǎng)過程中如果營養(yǎng)缺乏會導(dǎo)致細(xì)胞過早進入維持期并逐漸死亡，特別在細(xì)胞高密度培養(yǎng)工藝中，營養(yǎng)是制約細(xì)胞培養(yǎng)密度高低的重要因素。本試驗顯示，培養(yǎng)48 h 后最終細(xì)胞密度可達(dá)4.50×106cells/mL。之后，隨著培養(yǎng)時間增加細(xì)胞活率有所降低，這可能是因單位體積內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)不夠而導(dǎo)致。因此，應(yīng)根據(jù)實際生產(chǎn)中不同細(xì)胞株的生長代謝特性及病毒增殖需要，開發(fā)特定的低血清與無血清培養(yǎng)基。本研究用商品化專門適用于ST細(xì)胞馴化的ST-A 低血清培養(yǎng)基，只進行兩代次細(xì)胞傳代，培養(yǎng)細(xì)胞都擴增到2.00×106cells/mL 以上，表明ST 貼壁細(xì)胞快速適應(yīng)了ST-A 低血清培養(yǎng)基（含1% NBS）。用ST-S 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3 代后，細(xì)胞所能達(dá)到最終密度為3.00×106cells/mL以上，且細(xì)胞活率高于90%。

同一種病毒對同一細(xì)胞不同克隆株的敏感性不同，同一細(xì)胞所處外環(huán)境不同，同一病毒的敏感性也會有所差異[8]。本研究顯示，將適用于貼壁ST 細(xì)胞的PRV 毒株接種至懸浮ST 細(xì)胞，隨著盲傳代次增加，其逐步適應(yīng)在ST 懸浮細(xì)胞增殖且毒價有所提高，培養(yǎng)5 代后PRV 毒價達(dá)到109.00TCID50/mL，之后連續(xù)培養(yǎng)毒價都在109.00TCID50/mL 及以上，初步表明PRV sx-gE 毒株適應(yīng)了在ST 懸浮細(xì)胞中培養(yǎng)增殖。

綜上所述，通過選擇專用培養(yǎng)基和自主馴化，可使ST 細(xì)胞由貼壁轉(zhuǎn)為懸浮，并能在專用無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定傳代，在搖瓶中高密度懸浮生長，且PRV 適宜在ST 懸浮細(xì)胞中培養(yǎng)。