劉麗華，孫 菲，周志凌，張堅(jiān)松

（1. 珠海市人民醫(yī)院/暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院，珠海 519000；2. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高侵襲轉(zhuǎn)移是亟待解決的臨床治療難題［1］。新近的研究顯示非編碼調(diào)控性微小RNAs（microRNAs）能有效地抑制HCC 細(xì)胞遷移和侵襲［2，3］。我們先前的研究證明芹菜素（apigenin，API）類似物異牡荊素抑制HCC 腫瘤干細(xì)胞特性和侵襲能力［4］，然而，其作用機(jī)制尚未完全闡明。本文旨在研究API 是否通過上調(diào)miR-148a-3p 表達(dá)抑制體外HCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 高侵襲性人肝細(xì)胞癌MHCC97H 細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海市）。按照先前文獻(xiàn)的描述［4］，細(xì)胞放置在37°C、飽和濕度的5% CO2 培養(yǎng)箱中單層貼壁生長；然后，通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 模擬物或不同濃度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）聯(lián)合miR-148a-3p 抑制物轉(zhuǎn)染MHCC97H 細(xì)胞處理24 小時(shí)。

1.2 miRNA 轉(zhuǎn)染 如先前文獻(xiàn)［5］的闡釋的方法，按照制造商的說明（RiboBio，中國廣州市），用iboFECT?CP 試劑將micrON?miR-148a 模擬物（50 nM）或抑制物（100 nM）轉(zhuǎn)染入MHCC97H 細(xì)胞。同時(shí)，按照相同的方法和步驟轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 模擬物的陰性對照（miRCtrl）或miR-148a-3p 抑制物的陰性對照（Anti-Ctrl）。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 參考文獻(xiàn)［5］的實(shí)驗(yàn)方法，用miRcute miRNA 分離試劑盒（cat. DP501，Tiangen Biotech，中國）制備總microRNA?；赥aqMan MicroRNA 分析（Applied Biosystems）的All-in-One?miRNA qRT-PCR 檢測試劑盒轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增總miRNA（2μg），以測定microRNA 的量。用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。研究使用的引物是：成熟miRNA-148a-3p（F：TGCGGTCAGTGCACTACAGAAC；R：CCAGTGCAGGGTVVGAGGT）和內(nèi)參U6（F：5'-CGC TTC GGC AGC ACA TAT ACT A-3'；R：5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC A-3'。

1.4 劃痕法 參照文獻(xiàn)［4］的描述，轉(zhuǎn)染的MHCC97H細(xì)胞或不同濃度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）聯(lián)合miR-148a-3p 抑制物處理細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，生長至90%匯合度。然后，用無菌的100μL 微量移液器的吸頭垂直劃過形成傷口。接下來，洗滌細(xì)胞并分別于0 和24h 時(shí)在放大倍數(shù)為100 的視野中拍照分析。miR-Ctrl 或Anti-Ctrl 或溶媒（0.1%DMSO）處理MHCC97H 細(xì)胞用于標(biāo)化遷移細(xì)胞率（%）。

1.5 Transwell 小室侵襲試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［4］的描述，用基質(zhì)膠包被的8μm 孔膜Transwell 系統(tǒng)（Corning Incorporated，NY，USA）進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定。簡而言之，在有或沒有API 的況下，無血清DMEM 培養(yǎng)基懸浮的MHCC97H 細(xì)胞接種入上室。含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基加入下室中，作為化學(xué)誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)24 小時(shí)。侵襲細(xì)胞用甲醇固定，并行瑞氏染料染色，并用Vectashield 固定溶液（Vectorshield，Vector Laboratories）固定。光學(xué)顯微鏡（Olympus DP72，德國漢堡）拍照（放大倍數(shù)：200）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 20.0 軟件（IBM，Armonk，NY，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。非配對雙尾Student’s t 檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的均數(shù)。用單因素方差分析的post-hoc Tukey's 檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)的兩兩比較。P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a-3p 抑制MHCC97H 細(xì)胞遷移能力

圖1 顯示：miR-148a-3p 轉(zhuǎn)染顯著降低體外培養(yǎng)MHCC97H 細(xì)胞遷移率（P<0.05）。

圖1 miR-148a-3p模擬物抑制體外培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞遷移能力（mean±SD，n=3）

2.2 miR-148a-3p 降低MHCC97H 細(xì)胞侵襲率 圖2可見：miR-148a-3p 顯著降低體外培養(yǎng)MHCC97H 細(xì)胞侵襲率（P<0.05）。

圖2 miR-148a-3p模擬物抑制體外培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞侵襲能力（mean±SD，n=3）

2.3 API 上調(diào)MHCC97H 細(xì)胞miR-148a-3p 表達(dá)圖3 示：與0.1 % DMSO 處理的MHCC97H 細(xì)胞相比，API（5、10 和20μM）以濃度依賴方式增高M(jìn)HCC97H 細(xì)胞miR148a-3p 表達(dá)水平（P<0.05）。

圖3 API顯著上調(diào)MHCC97H細(xì)胞miR-148a-3p表達(dá)（mean±SD，n=3）RT-qPCR分析MHCC97H細(xì)胞miR-148a-3p表達(dá)水平。與溶媒（0.1%DMSO）處理的MHCC97H細(xì)胞相比：* P<0.05 ；與5.0μM API處理的MHCC97H細(xì)胞相比：#P<0.05。

2.4 API 抑制MHCC97H 細(xì)胞遷移和侵襲能力 如圖4 所示：API（5、10 和20μM）以濃度依賴方式降低MHCC97H 細(xì)胞遷移和侵襲率（P<0.05）。

圖4 API劑量依賴性抑制MHCC97H細(xì)胞遷移和侵襲（mean±SD，n=3）

2.5 miR-148a-3p 抑制物拮抗API 抑制MHCC97H細(xì)胞遷移和侵襲作用 miR-148a-3p 抑制物增強(qiáng)MHCC97H 細(xì)胞遷移（圖5 A；P<0.05）和侵襲能力（圖5 B；P<0.05），并且miR-148a-3p 抑制物能消除API 抑制細(xì)胞遷移和侵襲作用（圖5 A 和4B；P<0.05）。

圖5 miR-148a-3p抑制物對API抑制MHCC97H細(xì)胞遷移和侵襲的影響（mean±SD，n=3）

劃痕法和Transwell 小室法分別測定MHCC97H 細(xì)胞遷移（A）和侵襲（B）率。與miR-148-3p 抑制物陰性對照（Anti-Ctrl）轉(zhuǎn)染的MHCC97H 細(xì)胞相比：*P<0.05；與單獨(dú)API（20μM）處理的MHCC97H 細(xì)胞相比：#P<0.05；與單獨(dú)miR-148a-3p 抑制物轉(zhuǎn)染的MHCC97H細(xì)胞相比：$P<0.05。

3 討論

HCC 的高侵襲轉(zhuǎn)移特性是其致死的主要原因之一［1］。有研究表明，miR-148a 作為癌基因能增加IDH1 R132H 突變的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲；與此相反，miR-148a 作為抑癌基因有效抑制人胃癌［7］、卵巢癌［8］和非小細(xì)胞肺癌［9］，包括HCC［10］細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。與Huang 等報(bào)告的結(jié)果一致，本文的結(jié)果再次證實(shí)miR-148a-3p 模擬物有效地降低HCC 細(xì)胞遷移率和侵襲率。

API 屬于無基因毒性的飲食黃酮類化合物。Wang等人［11］最近報(bào)道API 通過影響microRNA 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)抑制HCC 細(xì)胞生長。我們先前的研究證實(shí)API 的糖苷類化合物（異牡荊素）具有抑制HCC 腫瘤干樣細(xì)胞遷移和侵襲作用［4］，然而，其作用分子機(jī)制有待深入研究。在本文的研究中，我們提呈了一種新的API 藥理分子機(jī)制認(rèn)識，即：API 通過上調(diào)miR-148a-3p 表達(dá)有效地抑制HCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力。在隨后的研究中，我們擬探討API 以何種方式上調(diào)miR-148a-3p 表達(dá)以及miR-148a-3p 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控何種或哪類靶基因發(fā)揮抑制人HCC 遷移和侵襲作用。