曹小妹，樂(lè)伊婕，林佳芝，寧舒婷，邱葉貝，曹建國(guó)，楊劍鋒，寧映霞

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120）

癌細(xì)胞的能量代謝重編程主要表現(xiàn)為有氧糖酵解，亦稱為沃伯格效應(yīng)，是惡性腫瘤的一個(gè)標(biāo)志［1］。在包括卵巢癌在內(nèi)的多種類型腫瘤中，miR-199a-5p 呈低表達(dá)狀態(tài)并且發(fā)揮抑癌作用［2］。我們先前證實(shí)，金雀異黃素，一種大豆及其制品的主要活性成分具有抗卵巢癌活性［3］。盡管已有研究報(bào)告金雀異黃素通過(guò)抑制肝細(xì)胞癌HIF-1α/GLUT1/HK2 信號(hào)軸介導(dǎo)的糖酵解誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞死亡［4］，然而，金雀異黃素能否調(diào)控卵巢癌細(xì)胞miR-199a-5p 表達(dá)和糖酵解仍然有待深入研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海市）。按照先前文獻(xiàn)的描述［3］，細(xì)胞用含10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素G和鏈霉素溶液的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，置37°C、飽和濕度的5% CO2 培養(yǎng)箱中單層貼壁生長(zhǎng)；此外，我們用預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定的亞細(xì)胞毒濃度的金雀異黃素（genistein，GEN：20、40μM）處理SKOV3 細(xì)胞24 小時(shí)。

1.2 miRNA 轉(zhuǎn)染 如先前文獻(xiàn)［5］的方法，按照制造商的說(shuō)明（RiboBio，中國(guó)廣州市），用iboFECT?CP 試劑轉(zhuǎn)染micrON?miR-199a 模擬物或抑制物（50 nM）（RiboBio，中國(guó)廣州，cat. no.miR112111170919-1-5）入SKOV3 細(xì)胞。此外，按照上述轉(zhuǎn)染的方法和步驟完成miR-199a 模擬物（miR-NC）的陰性對(duì)照或miR-199a 抑制物（Anti-Cont）的陰性對(duì)照的轉(zhuǎn)染。

1.3 qRT-PCR 參考文獻(xiàn)［2］的實(shí)驗(yàn)方法，用miRcute miRNA 分離試劑盒（cat. DP501，Tiangen Biotech，中國(guó)）制備總microRNA。基于TaqMan MicroRNA 分析（Applied Biosystems）的All-in-One?miRNA qRTPCR 檢測(cè)試劑盒轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增總miRNA（2μg），以測(cè)定microRNA 的量。U6 RNA 用作內(nèi)參。用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。miR-199a-5p 和內(nèi)參 U6 引物如下：

1.4 乳酸產(chǎn)物和葡萄糖消耗的測(cè)定實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6］的方法，使用不含酚紅的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞24 小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液。然后，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度根據(jù)與對(duì)照組相比的葡萄糖濃度差異確定葡萄糖消耗量。乳酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 20.0 for windows evaluation 軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 表示，采用One Way ANOVA 方差分析；多組均數(shù)比較采用Dunnett's t test 檢驗(yàn)。P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的糖酵解 乳酸產(chǎn)物和葡萄糖消耗測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-199a-5p 轉(zhuǎn)染顯著降低卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的乳酸產(chǎn)生（圖1 A；P<0.05）和葡萄糖消耗量（圖1B；P<0.05）。

圖1 miR-199a-5p對(duì)SKOV3細(xì)胞糖酵解的影響與培養(yǎng)基處理SKOV3細(xì)胞（Ctrl）相比：* P<0.05；與miR-199a-5p 模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞相比：# P<0.05（mean±SD，n=3）。

2.2 金雀異黃素上調(diào)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞miR-199a-5p 表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與0.1 %DMSO 處理SKOV3 細(xì)胞相比，亞細(xì)胞毒濃度的金雀異黃素（20.0μM、40μM）顯著上調(diào)SKOV3 細(xì)胞 miR199a-5p 表達(dá)水平；并且金雀異黃素上調(diào)miR-199a-5p 表達(dá)的作用呈濃度依賴趨勢(shì)（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 金雀異黃素對(duì)SKOV3細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)的影響與溶媒（0.1% DMSO）處理SKOV3細(xì)胞相比：* P<0.05；與20.0μM金雀異黃（GEN）處理SKOV3細(xì)胞相比，# P<0.05（mean±SD，n=3）。

2.3 金雀異黃素抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的糖酵解乳酸產(chǎn)物和葡萄糖消耗測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金雀異黃素減少卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的乳酸產(chǎn)生（圖3 A；P<0.05）和葡萄糖消耗（圖3 B；P<0.05）。

圖3 金雀異黃素對(duì)SKOV3細(xì)胞糖酵解的影響與溶媒（0.1% DMSO）處理的SKOV3細(xì)胞相比：* P<0.05（mean±SD，n=3）。GEN：金雀異黃素。

2.4 miR-199a-5p 抑制物救援金雀異黃素抑制SKOV3 細(xì)胞糖酵解作用 乳酸產(chǎn)物和葡萄糖消耗測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-199a-5p 抑制物轉(zhuǎn)染顯著增加卵巢癌SKOV3 細(xì)胞乳酸產(chǎn)生（圖4 A；P<0.05）和葡萄糖消耗（圖4 B；P<0.05），并且miR-199a-5p 抑制物能消除金雀異黃素減少卵巢癌SKOV3 細(xì)胞乳酸產(chǎn)生和葡萄糖消耗的作用（圖4 A 和4B；P<0.05）。

圖4 金雀異黃素聯(lián)合miR-199a-5p抑制物對(duì)SKOV3細(xì)胞糖酵解的影響與miR-199a-5p抑制物陰性（Anti-Ctrl）對(duì)照轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞相比：* P<0.05；與單獨(dú)金雀異黃素（GEN，40μM）處理的SKOV3細(xì)胞相比：#P<0.05；與單獨(dú)miR-199a-5p抑制物轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞相比：$ P<0.05（mean±SD，n=3）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的葡萄糖有氧酵解也稱為Warburg 效應(yīng)，在維持腫瘤細(xì)胞生存和發(fā)展中起關(guān)鍵作用［1］。近來(lái)的研究表明miRNAs 可作為抑癌因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖酵解［7，8］。但是抑癌性miR-199a-5p 對(duì)卵巢癌糖酵解的作用仍不清楚。在本文的研究中，我們的結(jié)果與Li 等人［9］在肝細(xì)胞癌中的研究結(jié)果一致，miR-199a-5p 減少卵巢癌SKOV3 細(xì)胞乳酸產(chǎn)生和葡萄糖消耗，這些結(jié)果表明miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的糖酵解。

金雀異黃素是在大豆和其他大豆產(chǎn)品中大量發(fā)現(xiàn)的一種異黃酮。我們先前的研究已經(jīng)證明它能抑制卵巢癌的干性特征［3］，但金雀異黃素對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞miR-199a-5p 表達(dá)及糖酵解的影響未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。在本文的研究中，我們率先發(fā)現(xiàn)亞細(xì)胞毒濃度的金雀異黃素不僅以濃度依賴趨勢(shì)上調(diào)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞miR-199a-5p 表達(dá)水平，并且能有效地抑制糖酵解。有趣的是，當(dāng)我們用miR-199a-5p 抑制物聯(lián)合金雀異黃素處理SKOV3 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p 抑制物能大部分消除金雀異黃素抑制SKOV3 細(xì)胞糖酵解作用，提示金雀異黃素可能通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的糖酵解。然而金雀異黃素為何能調(diào)控卵巢癌細(xì)胞miR-199a-5p 表達(dá)及糖酵解有待進(jìn)一步研究。

總之，我們的研究結(jié)果清楚的表明金雀異黃素能誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞miR-199a-5p 表達(dá)以及抑制糖酵解。這為金雀異黃素抗卵巢癌作用提供了新實(shí)驗(yàn)參數(shù)和理論依據(jù)；而且建議miR-199a-5p 有望成為靶向代謝特征治療卵巢癌的一個(gè)新靶點(diǎn)。