潘朝旺,戢丹菊
(鄂州職業(yè)大學 醫(yī)學院,湖北鄂州 436099)
膝骨關節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是關節(jié)軟骨緩慢地退行性病變,是中老年人常見、多發(fā)的關節(jié)病,且隨著年齡增大其發(fā)病率也升高[1]。目前KOA 的治療藥物以非甾體抗炎藥及激素為主,因其確切病因及發(fā)病機制尚不清楚,缺乏針對性治療藥物。金蕎麥別名苦蕎麥、野南蕎等,有清熱解毒、活血化瘀、健脾利濕的作用,我們在前期研究中,提示金蕎麥能減輕膝骨關節(jié)炎兔軟骨損傷[2]。本研究擬通過觀察金蕎麥提取物對膝骨關節(jié)炎大鼠血清、軟骨組織、關節(jié)液白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的影響,探討其治療膝骨關節(jié)炎的機制。
金蕎麥提取物(每g 相當于原藥材20g),購自西安草翠芯生物科技有限公司;壯骨關節(jié)丸(批號:20200617),購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司。
SPF 級SD 大鼠60 只,雌雄各半,體重200±20g,均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物許可證號為SCXK(湘)2015-0003。
IL-1β(批 號:20201218)、TNF-α(批 號:20201124)、IL-6(批號:20201226),ELISA 試劑盒,上海聯(lián)邁生物工程有限公司。
9602A 酶標儀,南京普朗醫(yī)用設備有限公司;Z160M 微量高速離心機,德國HERMLE;渡揚DOR YANG UV759 掃描型紫外可見分光光度計,渡揚精密儀器(上海)有限公司。
隨機挑選上述大鼠10 只作為正常組,其余50只參照文獻[3]制備骨關節(jié)炎模型:將實驗大鼠經(jīng)水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后,右后膝關節(jié)周邊去毛,消毒,分別在第1、4、7 天,屈曲關節(jié)45°以髕骨下級髕腱外緣為進針點,膝關節(jié)腔注入4%木瓜蛋白酶溶液0.2mL。造模完成后,將模型動物隨機分為5 組,每組10 只,即模型組、壯骨關節(jié)丸組、金蕎麥低、中、高劑量組,加上前面的正常組共6 組。最后一次注射木瓜蛋白酶后,給藥,金蕎麥低、中、高劑量組每天灌胃金蕎麥提取物0.14、0.28、0.56g/kg,壯骨關節(jié)丸組每天灌胃壯骨關節(jié)丸混懸液1.08g/kg,模型組和正常組每天灌胃生理鹽水5ml,連續(xù)給藥28 天,末次給藥24 小時后。觀察以下指標。
大鼠經(jīng)水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,取血約8ml,3500 rpm 離心10min,取上清液按試劑盒說明采用ELISA 法測定IL-1β、IL-6 和TNFα 含量。
參照文獻[4],抽取關節(jié)腔沖洗液,按試劑盒說明采用ELISA 法測定IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量。
取關節(jié)軟骨,剪碎,用生理鹽水1:20 勻漿,3500 rpm 離心10min,取上清液,按試劑盒說明采用ELISA 法測定IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量。
用spss21.0 軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析,采用均數(shù)±標準差()表示,用T 檢驗進行顯著性檢驗。
表1 可以看出,模型組血清IL-1β、IL-6、TNFα 明顯高于正常組(P<0.01);金蕎麥各劑量組和壯骨關節(jié)丸組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯低于模型組(P<0.05 或P<0.01)。
表1 各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 比較(,n=10)
表1 各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 比較(,n=10)
注:與模型組比較:* P<0.05,** P<0.01(下同)
見表2。與正常組比較,模型組關節(jié)液IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量明顯升高(P<0.01);各給藥組關節(jié)液IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量明顯低于模型組(P<0.05 或P<0.01)。
表2 各組關節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α 比較(,n=10)
表2 各組關節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α 比較(,n=10)
見表3,同血清和關節(jié)液一樣,模型組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯高于正常組(P<0.01);各給藥組軟骨組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量明顯低于模型組(P<0.05 或P<0.01)。
表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α 比較(,n=10)
表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α 比較(,n=10)
研究表明,KOA 的病理發(fā)展與炎性細胞因子密切相關,其中IL-1β、TNF-α 作為炎癥反應的始動因素[5],是KOA 發(fā)病進程中的重要介質。IL-1β、TNF-α 作為主要蛋白質因子參與機體免疫系統(tǒng)調節(jié)骨代謝,它們互相協(xié)調,介導關節(jié)組織的破壞,誘導軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解,它們在軟骨組織含量與破壞嚴重程度密切相關[6]。IL-1β 可抑制軟骨細胞增殖和軟骨組織蛋白多糖合成,促進基質金屬蛋白酶合成與釋放,刺激軟骨組織一氧化氮和前列腺素E2 合成,從而加快軟骨基質降解,加重關節(jié)的炎癥反應。研究顯示,誘發(fā)大鼠膝骨關節(jié)炎后,大鼠產(chǎn)生炎癥反應,血清、關節(jié)液和軟骨組織IL-1β、TNF-α 含量明顯高于正常組,金蕎麥各劑量組均能明顯降低大鼠以上炎性因子(表1、2、3)。
IL-6 是活化的T 細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子,是一種功能廣泛的多效性細胞因子。急性炎癥反應過程中IL-6 會快速生成,在KOA 病理發(fā)展過程中,IL-6 可增加滑膜組織的炎性反應,促進炎性細胞的浸潤,加重局部組織炎性水腫,破骨樣細胞的形成加快,軟骨的降解破壞加速。此外,IL-6 還通過自分泌形式作用于軟骨細胞,進而影響軟骨細胞正常增殖。研究發(fā)現(xiàn),IL-6 含量在KOA 患者血清中均高于健康人[7]。IL-6 表達水平在早期KOA 患者血清中明顯升高,并且與病情的嚴重程度呈正相關[8]。本研究結果顯示,IL-6 表達在模型大鼠體內明顯高于模型組,與前述研究基本一致。同時,實驗表明,金蕎麥各劑量組均能明顯降低大鼠血清、軟骨組織、關節(jié)液IL-6(表1、2、3)。
綜上,金蕎麥提取物可降低血清、關節(jié)液和軟骨組織IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量,為其用于治療膝骨關節(jié)炎提供實驗依據(jù)。