陳秀紅, 李 坤, 靳 爽, 張中冕

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 腫瘤科, 河南 鄭州, 450014)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的常見病理類型包括腺癌(LUAD)及鱗癌(LUSC)[1]。目前, NSCLC的治療已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從細(xì)胞毒藥物階段、分子靶向治療階段向以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療階段的顯著改變，尤其是免疫治療進(jìn)展迅速，在NSCLC、腎癌、霍奇金淋巴瘤等多種腫瘤治療中均有獲益，但總體療效仍不理想[2]。免疫治療主要機(jī)制包括了程序性死亡受體-1(PD1)及其配體(PD-L1)通路的阻斷, PD-L1及PD1為免疫治療的重要靶點(diǎn); PD-L1廣泛表達(dá)于癌細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞等，與PD1的結(jié)合可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能受損，故PD-L1抑制劑特異性靶向PD-L1蛋白可以避免腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生[3]。PD-L1作為典型的跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白，多項(xiàng)研究[4-9]揭示其轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子如二甲雙胍、趨化素樣因子超家族(CMTM)、亨廷頓相互作用蛋白1相關(guān)蛋白(HIP1R)、外泌體以及各種翻譯后修飾，其中的糖基化、磷酸化、棕櫚?；头核鼗绕渲匾?。糖基化的PD-L1影響參與泛素化過程酶的磷酸化，阻斷了泛素E3連接酶識別PD-L1, 從而影響PD-L1泛素化。PD-L1磷酸化影響其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，缺失磷酸化的PD-L1被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白消除。棕櫚?；ㄟ^阻斷PD-L1泛素化保持PD-L1的穩(wěn)定，抑制溶酶體對PD-L1的降解[10]。

卵巢腫瘤泛素異肽酶1(OTUB1)是卵巢腫瘤域蛋白酶去泛素酶家族成員之一，在腫瘤及神經(jīng)退化等疾病中發(fā)揮重要作用，作用機(jī)制包括了下調(diào)泛素化調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性等[11]。近期研究[12]發(fā)現(xiàn)，OTUB1阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)PD-L1降解，明確包括了乳腺癌、肺癌、腎癌及肝癌細(xì)胞系等。目前OTUB1在NSCLC組織方面的研究較少，NSCLC中OTUB1是否存在對PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步探索，也能為提高免疫治療效果提供可選擇方案。本研究通過評價腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(TCGA)中NSCLC組織及癌旁正常組織的OTUB1 mRNA差異性，回顧性分析NSCLC組織及癌旁正常組織中OTUB1蛋白差異性?；诨虮磉_(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)探討數(shù)據(jù)庫中NSCLC的OTUB1與PD-L1 mRNA相關(guān)性，采用免疫組織化學(xué)染色(IHC)測定NSCLC組織中OTUB1及PD-L1蛋白表達(dá)，探究兩者相關(guān)性及OTUB1表達(dá)與臨床特征及對無復(fù)發(fā)生存期(RFS)的影響，探討非小細(xì)胞肺癌免疫治療的可能方向，闡明NSCLC可能的發(fā)生機(jī)制及新的RFS預(yù)測因素。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫Genomic Date Commons Portal(GDC)(https: //portal.gdc.cancer.gov) (2021年4月30日)中下載LUAD(n=535)及癌旁正常組織(n=59)和LUSC(n=502)及癌旁正常組織(n=49)的OTUB1 表達(dá)數(shù)據(jù)，下載的OTUB1表達(dá)數(shù)據(jù)類型為采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)所獲得的HTSeq-FPKM數(shù)據(jù)[13]; 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析其數(shù)據(jù)庫下載的NSCLC中OTUB1與PD-L1 mRNA表達(dá)相關(guān)性[14]。

1.2 組織樣本來源

收集2016年6月—2019年12月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理確診為NSCLC并接受了肺癌切除術(shù)及淋巴結(jié)清掃術(shù)的患者的癌組織46例及癌旁正常肺組織蠟塊包埋樣本41例。納入標(biāo)準(zhǔn): 病理確診為NSCLC、明確的TNM分期、完整的隨訪記錄及臨床信息(包括年齡、性別、吸煙史、分化程度及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)等)、至少接受術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)治療者。排除標(biāo)準(zhǔn): 術(shù)前接受放化療、免疫治療、其他腫瘤病史、死因非肺癌患者。NSCLC者46例，中低分化15例，高分化31例; Ⅰ～Ⅱ期30例, Ⅲ期16例; 年齡29～74歲，有吸煙史26例，無吸煙史20例; 肺鱗癌22例，肺腺癌24例，癌旁正常組織41例。截至2021年5月30日，對所有患者隨訪，包括門診隨訪、入院檢查及電話回訪。無復(fù)發(fā)生存期(RFS)指手術(shù)至腫瘤復(fù)發(fā)或者任何原因死亡的時間(以月為單位)。本臨床研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理批件號2021209)。

1.3 免疫組織化學(xué)(IHC)及評分

IHC染色采用的試劑來自單克隆兔抗OTUB1抗體(affbiotech, 編號DF9998)和多克隆兔抗PD-L1抗體(Abcam, 編號ab213524)。實(shí)驗(yàn)步驟如下: 石蠟切片脫蠟、水化及修復(fù), 3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗(OTUB1為1∶400, PD-L1為1∶150)后4 ℃過夜; 加二抗孵育, DAB顯色、蘇木素復(fù)染及脫水封片。PD-L1根據(jù)腫瘤比例評分(TPS)標(biāo)準(zhǔn): 即任何染色強(qiáng)度的PD-L1膜染色的腫瘤細(xì)胞在所有腫瘤細(xì)胞中所占百分比，定義膜染色有0分(<1%)、1分(1%～<50%)、2分(≥50%), 0分為陰性表達(dá)組，≥1分為陽性表達(dá)組。OTUB1評分標(biāo)準(zhǔn): 隨機(jī)選取切片的5個視野(放大倍數(shù)400倍)，參考抗體說明書，按細(xì)胞質(zhì)中染色強(qiáng)度評分: 即0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色); 結(jié)合陽性細(xì)胞所占百分比，評估為0分(≤5%)、1分(>5%～25%)、2分(>25%～50%)、3分(>50%～75%)和4分(>75%)。OTUB1表達(dá)以0～4分為陰性表達(dá), 5～12分為陽性表達(dá)。病理切片由鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2位病理醫(yī)師獨(dú)立、盲法評分，分析PD-L1、OTUB1的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件中“l(fā)imma”及“beeswarm”包分析來源于TCGA中癌組織與癌旁正常組織中OTUB1表達(dá)情況，應(yīng)用wilcox. test統(tǒng)計(jì)分析并描繪散點(diǎn)圖。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，相關(guān)性分析采用Sperman等級相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)，對有意義的預(yù)后因素應(yīng)用COX回歸多因素分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)、率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC組織與癌旁正常組織中OTUB1mRNA及蛋白表達(dá)差異結(jié)果

TCGA下載的LUAD(n=535)及癌旁正常組織(n=59)的OTUB1 mRNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); TCGA下載的LUSC(n=502)及癌旁正常組織(n=49)的OTUB1 mRNA比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。IHC顯示OTUB1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，見圖2。46例肺癌組織中, OTUB1陽性28例(60.9%), 陰性18例(39.1%); 相應(yīng)的41例癌旁正常組織中, OTUB1陽性15例(36.6%), 陰性26例(63.4%); 肺癌組織與癌旁正常組織的OTUB1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示NSCLC組織中OTUB1 mRNA及蛋白表達(dá)均高于癌旁正常組織。

A: TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD及癌旁正常組織OTUB1 mRNA比較; B: TCGA數(shù)據(jù)庫中LUSC及癌旁正常組織OTUB1 mRNA比較。

2.2 NSCLC組織中OUTB1與PD-L1在mRNA、蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

基于GEPIA應(yīng)用Spearman分析來自其數(shù)據(jù)庫中NSCLC的OTUB1與PD-L1 mRNA水平表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示無相關(guān)性(r=-0.006,P=0.850), 見圖3。46例肺癌組織中, OTUB1陽性28例(60.9%), 陰性18例(39.1%); PD-L1陽性27例(58.7%), 陰性19例(41.3%); Spearman相關(guān)性分析提示兩者蛋白水平具有相關(guān)性(r=0.323,P=0.029)。

2.3 NSCLC組織中OTUB1表達(dá)與各臨床特征的關(guān)系

不同TNM分期患者OTUB1表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.278,P=0.039), 見表1。

表1 NSCLC組織中OTUB1表達(dá)與各臨床特征的關(guān)系

2.4 NSCLC患者術(shù)后RFS的影響因素分析

TNM分期(P<0.001)、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個數(shù)(P=0.001)、分化程度(P=0.042)是RFS的影響因素; OTUB1陰性、陽性表達(dá)患者的中位RFS分別18、19個月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLC患者術(shù)后RFS的影響因素分析(Kaplan-Meier法)

2.5 NSCLC患者術(shù)后RFS影響因素的多因素分析

根據(jù)Kaplan-Meier單因素分析結(jié)果，以轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)、分化程度、TNM分期建立COX多因素風(fēng)險模型，結(jié)果提示分化程度(Hr=3.143, 95%CI為1.407～7.024,P=0.005)及TNM分期(Hr=3.467, 95%CI為1.425～8.435,P=0.006)是影響RFS的獨(dú)立危險因素，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)不是影響RFS的獨(dú)立危險因素(Hr=2.267, 95%CI為0.859～5.980,P=0.098)。

3 討 論

近年來研究[15-16]表明, OTUB1在調(diào)控細(xì)胞增殖、代謝及代謝相關(guān)蛋白方面具有重要作用，并在胃腺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌中均發(fā)現(xiàn)了OTUB1的高表達(dá)。KARUNARATHNA U等[17]證實(shí)了OTUB1下調(diào)FOXM1泛素水平而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力; IGLESIAS-GATO D等[18]也闡述了OTUB1上調(diào)二氫睪酮誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞株的侵襲力; 但有關(guān)肺癌中OTUB1的表達(dá)的相關(guān)研究卻較少。PD-L1作為免疫治療的主要研究點(diǎn)，除了在遺傳、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及翻譯等方面進(jìn)行研究外，其在蛋白泛素化方面的調(diào)控也逐漸成為研究的熱點(diǎn)[19]。本研究采用生物信息學(xué)與免疫組化實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法探討OTUB1在肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，發(fā)掘可能調(diào)控PD-L1的新方向。

相較于OTUB2等其它OTUB1家族成員, OTUB1在泛素鏈切割方面具有較高的特異性，僅對K48連接多聚泛素鏈切割，此方式也是OTUB1下調(diào)泛素化的經(jīng)典機(jī)制。除此之外, OTUB1通過與攜帶泛素的E2連接酶結(jié)合而阻止泛素向蛋白底物的轉(zhuǎn)移[20-21]。ZHU D等[12]發(fā)行BT-549及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系敲除OTUB1后PD-L1蛋白水平顯著降低，且OTUB1的缺失對其影響只限于蛋白水平，其mRNA豐度并未受到影響。其機(jī)制可能正是OTUB1發(fā)揮了去泛素化酶作用，使PD-L1蛋白保持了較低的泛素化狀態(tài)，避免其在胞質(zhì)內(nèi)被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解復(fù)合體(ERAD)降解?；贕EPIA分析顯示, OTUB1 mRNA及PD-L1 mRNA無明顯相關(guān)性，一定程度上預(yù)測了兩者在基因水平上相互調(diào)控或者被同一因素調(diào)控的可能性較低。本實(shí)驗(yàn)采用IHC首次發(fā)現(xiàn)了NSCLC組織中OTUB1與PD-L1蛋白呈正相關(guān)，佐證了兩者可能存在蛋白水平調(diào)節(jié)的假設(shè)，此假設(shè)也與乳腺癌中已證實(shí)了的OTUB1經(jīng)下調(diào)PD-L1泛素化而避免其被降解的機(jī)制相符合。ZHU D等[12]發(fā)現(xiàn)NSCLC的A549細(xì)胞中OTUB1缺失引起了OTUB1蛋白量下降，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

研究[22-25]表明, PD-L1表達(dá)水平的升高與腎細(xì)胞癌、肺癌、卵巢癌、鼻咽癌等癌癥的抗PD-L1療效及生存預(yù)后較差相關(guān)。PD-L1作為膜蛋白的一種，大部分均經(jīng)歷了持續(xù)的代謝和內(nèi)化，其釋放的動態(tài)循環(huán)和調(diào)控影響了細(xì)胞膜上PD-L1的數(shù)量，目前的免疫治療可能只針對暫時暴露于細(xì)胞表面的PD-L1[8]。此結(jié)果為靶向PD-L1提供了新的調(diào)控點(diǎn)，也為增強(qiáng)免疫治療成效提供了可能性。本研究通過分析來源于TCGA中數(shù)據(jù)及IHC驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了OTUB1較癌旁正常組織表達(dá)上調(diào)，提示了其在NSCLC發(fā)生中可能具有一定的作用。BAIETTI M F等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在OTUB1下調(diào)RAS泛素化激活下游MAPK通路，成為野生RAS型非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的重要機(jī)制。LI Y等[27]研究卻揭示了OTUB1通過阻斷UbcH5降低P53泛素化，從而維持P53穩(wěn)定性，使得P53在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖方面發(fā)揮作用。ZHOU Y等[15]研究亦發(fā)現(xiàn)了OTUB1陽性表達(dá)為肺腺癌早期事件，與本研究Ⅲ期患者中陽性表達(dá)率較高不一致，考慮可能與入組病例數(shù)較少、納入標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

本研究的局限性: ① 本研究存在臨床納入病例數(shù)較少的問題，缺乏大規(guī)模臨床入組。② OTUB1與PD-L1相關(guān)性僅局限于人肺腺癌、肺鱗癌病理類型，兩者之間mRNA關(guān)系僅來自于生物信息學(xué)分析。③ 由于實(shí)驗(yàn)條件限制，缺乏肺癌細(xì)胞系中OTUB1與PD-L1蛋白水平相關(guān)性的驗(yàn)證，即在NSCLC細(xì)胞系中敲除OTUB1 mRNA, 行PD-L1 mRNA及蛋白水平檢測，在NSCLC中OTUB1調(diào)節(jié)PD-L1的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中OTUB1與PD-L1蛋白水平呈正相關(guān)，在NSCLC中也呈現(xiàn)高表達(dá)，提示OTUB1可能是PD-L1潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制中至關(guān)重要的一環(huán)，也表明其在NSCLC發(fā)生中可能發(fā)揮一定的作用。