李洋，羅佳沂，林鳳，毛瑞豐，李凱

(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004)

紅糟酸(red vinasse acid)是產(chǎn)于廣西來賓市武宣縣的一種風(fēng)味獨(dú)特的食物，其顏色鮮艷、酸甜適口，可謂是色、香、味俱全，而且紅糟還可以促消化，具有一定保健作用，深受當(dāng)?shù)厝嗣竦南矏?。紅糟酸是在稍高于室溫的環(huán)境溫度下，將紅糟配上適量醋和米酒，與煮熟的米飯拌勻，然后清洗、發(fā)酵、晾涼，投入辣椒、生姜等泡制而成。紅糟酸不僅色鮮味濃，而且具有對(duì)人體有益的功效，例如軟化血管、幫助消化、增加食欲等，是一種老少皆宜的食品[1]。

紅糟酸的品質(zhì)與微生物的代謝有密切聯(lián)系，例如醋酸桿菌屬、片球菌屬、乳酸桿菌屬等，但不同地區(qū)由于制作原料及制作環(huán)境的影響，對(duì)紅糟酸中的微生物種類及含量也會(huì)有一定影響，目前對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間和不同地區(qū)產(chǎn)紅糟酸的差異性研究比較少。

高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing，NGS)，又稱“下一代”測序技術(shù)，一次可以對(duì)幾十萬至幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，這種測序技術(shù)已經(jīng)在發(fā)酵食品及環(huán)境生物中廣泛應(yīng)用，用于微生物群落的分析[2-3]。沈琦等[4]利用高通量技術(shù)分析了鹽地堿蓬根際細(xì)菌群落多樣性，檢測出355個(gè)屬，變形菌門的細(xì)菌屬占比接近50%；Chen等[5]采用PCR-DGGE技術(shù)探究泡菜發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)微生物菌群以及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，揭示了泡菜中微生物的多樣性。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測序技術(shù)對(duì)武宣縣不同村莊的紅糟酸成品及發(fā)酵過程進(jìn)行微生物多樣性分析，為提高紅糟酸的品質(zhì)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品地理位置情況(見圖1)：廣西壯族自治區(qū)來賓市武宣縣(北緯23°19′～23°56′，東經(jīng)109°27′～109°46′)，東北面與金秀縣為界，西南面與桂平市、貴港市毗鄰，西面與來賓市興賓區(qū)接壤，北面與象州縣交界，縣境面積1739.45 km2，東西最大橫距50.2 km，南北最大縱距68.6 km。武宣縣地處廣西中部，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)。北回歸線橫貫武宣縣南部，全年太陽輻射強(qiáng)。春秋干旱較頻繁，夏多洪澇，冬有霜凍。年平均氣溫為21.3 ℃。雨水充沛，分布不均，年平均降雨量為1243.6 mm。

圖1 采樣點(diǎn)位置圖

樣品：樣品DX、ET、SL、HM以及7個(gè)發(fā)酵過程樣是來賓市武宣縣不同村莊的紅糟酸。

1.1.2 主要試劑

1.1.3 主要儀器

1.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.2.1 樣品的收集與處理

收集：2020年8月下旬，在來賓市武宣縣4個(gè)地點(diǎn)，各收集1種成品紅糟酸及7種發(fā)酵過程中的紅糟酸，裝入無菌密封塑料袋中，置于冰盒中，快速運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后在-20 ℃條件下冷凍保藏待用。

處理：稱取200 mg紅糟酸汁，加入滅菌后的2 mL離心管中，加入1×PBS溶液，振蕩混勻，以10000 r/min在室溫下離心3 min，棄置上層液體。

1.2.2 總DNA的提取

按Omega DNA提取試劑盒說明書，從11個(gè)紅糟酸樣品中提取微生物總DNA，利用瓊脂糖凝膠檢測DNA的完整性，用Qubit定量檢測DNA樣本濃度。16S rRNA和ITS序列分析：進(jìn)入NCBI數(shù)據(jù)庫，采用BLAST分別對(duì)所得細(xì)菌和真菌目標(biāo)序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行比對(duì)，刪除結(jié)果中錯(cuò)位區(qū)、冗雜區(qū)，將處理好的目標(biāo)序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列采用MEGA 7.0軟件[6]計(jì)算序列的堿基組成百分比(nucleotide composition)[7]，基于Kimura 2-parameter模式對(duì)上述目標(biāo)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行遺傳距離計(jì)算[8]，基于neighbor-joining (NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]，并對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度進(jìn)行檢驗(yàn)[10]。

1.2.3 高通量測序

擴(kuò)增程序[11]：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性 30 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共20個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。利用Min Eluter PCR Purification Kit對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化目的產(chǎn)物后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行高通量建庫與微生物多樣性分析。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

根據(jù)97%相似性，將非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類。利用RDP Classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU進(jìn)行分類學(xué)分析[12]，統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)和發(fā)酵時(shí)間紅糟酸樣品的微生物在不同水平的群落組成。利用Mothur軟件繪制稀釋性曲線，利用QIIME[13]軟件計(jì)算樣品的各種多樣性指數(shù)，利用Excel軟件構(gòu)建群落分布柱狀圖、數(shù)據(jù)分析表等。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU聚類分析

在分析中引入OTU分析，首先對(duì)相似序列進(jìn)行聚類，分成數(shù)量較少的分類單元進(jìn)行分析，即OTU聚類分析，既可以簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，也可去除一些測序錯(cuò)誤序列，從而得到樣品中的微生物多樣性及不同微生物的豐度。

由圖2可知，4個(gè)樣品共有的細(xì)菌OTU數(shù)為77個(gè)，HM和SL無特有的OTU，ET和DX各有1個(gè)，樣品共有的真菌OTU數(shù)為5個(gè)。

圖2 成品樣微生物OUTs Venn圖

由圖3可知，7個(gè)過程樣共有的細(xì)菌OTU數(shù)為84個(gè)，共有的真菌數(shù)為8個(gè)。紅糟酸制作前，需將紅曲米種子用白醋泡發(fā)，打成勻漿，從而改變其發(fā)酵環(huán)境，降低發(fā)酵過程中的pH值，導(dǎo)致部分微生物的生長被抑制。真菌對(duì)于低pH環(huán)境具有耐受性，從而使其OTU數(shù)在發(fā)酵中期回升。

圖3 過程樣OUTs Venn圖

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)或特定環(huán)境中的多樣性，主要用于反映物種豐度、均勻度、測試深度。

續(xù) 表

由表1和表2可知11個(gè)樣品的細(xì)菌和真菌群落多樣性。在觀察到的樣品物種數(shù)和物種豐度指數(shù)中，D15是7個(gè)發(fā)酵樣(Seeds～D15)中細(xì)菌物種總數(shù)相對(duì)較大的，在成品對(duì)比中，SL是成品紅糟酸中細(xì)菌物種總數(shù)和物種豐度最高的；通過Shannon和Simpson值可以看出，細(xì)菌的多樣性在發(fā)酵過程中略有波動(dòng)，且在成品紅糟酸中細(xì)菌多樣性最高。由表2可知，11個(gè)樣品中D6、D9和D15的真菌物種總數(shù)較大，且樣品中真菌多樣性波動(dòng)較小。Alpha多樣性指數(shù)顯示過程樣與成品樣之間波動(dòng)較大。

表1 樣品細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)

表2 樣品真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of fungal communities of samples

2.3 紅糟酸中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 成品樣中微生物群落分析

由圖4可知，醋酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和片球菌屬在紅糟酸成品中占比較高，醋酸桿菌屬在樣品HM、SL和ET中較多，分別占比55.88%、53.99%和50.89%，醋酸桿菌屬可以氧化乙醇成醋酸[14]，是樣品HM、SL和ET主要的產(chǎn)酸途徑，DX中較少，占比6.46%，可能與當(dāng)?shù)氐纳a(chǎn)環(huán)境有很大關(guān)聯(lián)?？死撞暇鷮僭贒X中占比最多，約為80.52%，這種菌屬如果含量過高，可能會(huì)對(duì)紅糟酸的品質(zhì)和口感有影響。片球菌屬能賦予食品柔和的酸味及香氣，改進(jìn)食品的品質(zhì)和營養(yǎng)，具有耐酸、耐高溫特點(diǎn)，還具有抗腫瘤、降低膽固醇的生物學(xué)功能[15-16]，在SL中占比較多，為25.8%，在HM、ET和DX中分別占比9.97%、8.44%和3.64%。乳酸桿菌屬可以產(chǎn)生乳酸和多種抗菌物質(zhì)，乳酸桿菌屬細(xì)胞內(nèi)碳水化合物活性酶存在特異性[17]，在發(fā)酵過程中，乳酸的數(shù)量影響發(fā)酵的質(zhì)量，乳酸菌屬在樣品HM、SL、ET和DX中分別占比1.42%、5%、10.43%和0.4%。伯克霍爾德菌屬在HM、SL、ET和DX中分別占比3.63%、3.83%、2.86%和2.88%，有研究表明伯克霍爾德菌屬中的大多數(shù)物種都使用氧氣作為電子受體降解芳香化合物。阪崎腸桿菌屬在HM、SL、ET和DX中分別占比0.85%、0.004%、0.57%和2.4%，此菌屬耐高溫、不耐酸[18]。芽孢桿菌屬通過代謝產(chǎn)酸，在ET和DX中均未檢出，在HM中占比小于1，為0.019%，在SL中為3.61%，不動(dòng)桿菌屬通過代謝消耗碳水化合物產(chǎn)酸，在HM、SL和DX中占比均小于1，分別為0.13%、0.16%和0.12%，在ET中占比1.17%。在屬水平上，紅糟酸成品真菌優(yōu)勢(shì)菌均為紅曲霉，在HM和SL中有一定比例的念珠球菌，但占比均較低。總的來說，4種成品紅糟酸中，DX與 SL、HM及ET的菌間差異較大，DX優(yōu)勢(shì)菌屬為克雷伯氏菌，其他菌種相對(duì)豐度較小；SL、HM和ET優(yōu)勢(shì)菌屬為醋酸桿菌，且在HM中相對(duì)豐度最高，SL中片球菌相對(duì)豐度較HM和ET高，ET中乳酸菌相對(duì)豐度較SL和HM高，其余菌屬在4種樣品中均占比較低，這可能與當(dāng)?shù)氐臍夂蛞约安僮鳝h(huán)境和方法有關(guān)。

圖4 屬水平成品樣群落結(jié)構(gòu)

2.3.2 過程樣中微生物群落分析

由圖5可知，在屬水平上，伯克霍爾德菌屬和克雷伯氏菌屬在整個(gè)發(fā)酵過程中占比較大。其中，伯克霍爾德菌屬、克雷伯氏菌屬和未分類菌在種子中占比較大，分別為60.97%、10.35%和9.89%。發(fā)酵到第3天，克雷伯氏菌屬含量大量減少，伯克霍爾德菌屬和未分類菌有所增加，分別為40.49%、34.4%和14.78%。發(fā)酵到第6天，伯克霍爾德菌屬、克雷伯氏菌屬和乳酸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，分別為37.69%、36.62%和14.29%。發(fā)酵到第9天，乳酸桿菌屬成為最大的優(yōu)勢(shì)菌，為66.02%，現(xiàn)已有眾多報(bào)道證明，乳酸桿菌屬為發(fā)酵中主導(dǎo)菌系[19-20]，其次為克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬，分別為17.36%和10.2%。發(fā)酵到第12天，乳酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬為優(yōu)勢(shì)菌種，分別為30.83%、25.39%和31.34%。發(fā)酵到第15天，乳酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬為優(yōu)勢(shì)菌種，分別為43.81%、14.44%和34.34%。紅糟酸成品中，乳酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬為優(yōu)勢(shì)菌種，分別為32.27%、24.25%和35.25%。在屬水平上，紅糟酸過程樣真菌優(yōu)勢(shì)菌均為紅曲霉。發(fā)酵中期，念珠球菌隨發(fā)酵時(shí)間的延長有所增加，但占比較小。由上述研究可知，伯克霍爾德菌屬和克雷伯氏菌屬在發(fā)酵過程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，未分類菌屬在發(fā)酵前期占優(yōu)勢(shì)，乳酸菌在發(fā)酵后期占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

圖5 屬水平過程樣群落結(jié)構(gòu)

在泡菜發(fā)酵過程中，會(huì)產(chǎn)生一些與發(fā)酵無關(guān)的菌，甚至是有害菌。在紅糟酸中存在伯克霍爾德菌、克雷伯氏菌、大腸桿菌(E.coli)、阪崎腸桿菌、黃單胞桿菌、類芽孢桿菌等有害菌，大腸桿菌是常見的腸道菌，也是食品中常用的糞源性污染衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)[21]，該菌耐高溫，55 ℃下可存活60 min且其最適pH為7.2～7.4，大腸桿菌在紅曲米中限量為3.0 MPN/100 g，因此該菌是威脅紅糟酸安全的微生物。此產(chǎn)生的原因可能與制作過程中操作環(huán)境、工作人員衛(wèi)生規(guī)范以及原料有關(guān)。據(jù)觀察，紅糟酸制作過程中環(huán)境雖較干凈，但并未做到完全無菌，加上在對(duì)紅曲米制作工藝考察中發(fā)現(xiàn)，紅曲米制作過程中使用自來水洗米，發(fā)酵晾曬環(huán)境也沒有做到無菌，都可能是導(dǎo)致在樣品中檢測出大腸桿菌的原因。因此，在整個(gè)制作過程中要嚴(yán)格把控原材料以及操作人員的衛(wèi)生健康問題，對(duì)直接接觸食品的水要進(jìn)行殺菌。

由圖6可知，紅糟酸發(fā)酵前期，伯克霍爾德菌屬、駒形桿菌屬、類芽孢桿菌屬呈增加趨勢(shì)，達(dá)到峰值后逐漸下降。片球菌屬在發(fā)酵前期占比幾乎為零，在發(fā)酵達(dá)到峰值后逐漸下降，乳酸桿菌屬和片球菌屬均屬于乳酸菌的范疇[22]。醋酸菌屬、大腸桿菌在發(fā)酵初期略有增加后一直呈下降趨勢(shì)?？死撞暇鷮?、黃單胞桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、克羅諾桿菌屬、弗朗克氏桿屬在種子中占比較大，之后呈大幅度下降趨勢(shì)，在下降過程中有小幅度波動(dòng)。乳酸桿菌屬、桿菌屬在發(fā)酵前中期占比上升至峰值后下降。

圖6 紅糟酸發(fā)酵過程微生物變化

在真菌中，紅曲霉在種子中占比最高，在發(fā)酵中期緩慢下降至最低并隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸上升，酵母菌的變化規(guī)律與紅曲霉相反。Diutina，Cyberlindnera，unclassified，Pseudallescheria占比在發(fā)酵后期無增加后下降。畢赤酵母菌占比在發(fā)酵前期增加至峰值后下降。念珠菌屬、Dekkera的占比在發(fā)酵前中期上升至峰值后下降。Kregervanrija、曲霉菌在種子中占比最高，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行占比幾乎為零。

2.4 發(fā)酵過程樣與成品中優(yōu)勢(shì)微生物群落分析

由圖7可知，過程樣與成品樣對(duì)比發(fā)現(xiàn)，克雷伯氏菌屬、紅曲霉、畢赤酵母菌和念珠菌屬貫穿整個(gè)發(fā)酵過程，在成品中均存在，而未分類菌和Diutina只在發(fā)酵中存在，在成品中未見到，成品中的優(yōu)勢(shì)菌增加了醋酸桿菌屬和片球菌屬?，F(xiàn)有關(guān)紅糟酸的報(bào)道較少，但在泡菜和發(fā)酵食品相關(guān)的研究中，均發(fā)現(xiàn)了與紅糟酸相同的優(yōu)勢(shì)菌屬。金華等[23]基于MiSeq高通量測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵蔬菜片球菌屬和乳酸桿菌屬為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，最高占比為59.59%。寧明等[24]對(duì)不同地區(qū)辣椒醬進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬等為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。這些優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味及品質(zhì)有一定的影響，但對(duì)紅糟酸的風(fēng)味和品質(zhì)是否有影響還需進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

圖7 樣品優(yōu)勢(shì)菌群落結(jié)構(gòu)

3 討論與展望

本文對(duì)來自廣西來賓市武宣縣不同村莊的紅糟酸進(jìn)行微生物群落多樣性分析，其中，伯克霍爾德菌和克雷伯氏菌在發(fā)酵過程中占比較大，醋酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和片球菌屬在成品中占比較大。紅曲霉菌是樣本中真菌優(yōu)勢(shì)菌且抑制了酵母菌的生長。在紅糟酸發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)了一些非發(fā)酵菌和致病菌，這提示在紅糟酸制品中存在微生物安全性問題，應(yīng)將使用無菌水，原料清洗晾曬這一環(huán)節(jié)改為無菌操作，在灌裝前增加乳酸桿菌屬添加步驟。

紅糟酸的發(fā)酵與復(fù)雜的微生物區(qū)系相關(guān)，微生物種類和區(qū)系結(jié)構(gòu)對(duì)紅曲制品的產(chǎn)量、質(zhì)量和風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用。本文為進(jìn)一步對(duì)紅糟酸安全性評(píng)價(jià)的研究提供了理論基礎(chǔ)，為日后紅糟酸制作中微生物病害控制提供了積極的參考意見。