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        納豆枯草芽孢桿菌對(duì)老陳醋中阿魏酸的影響

        2022-01-12 06:17:50董紅兵蔡凱黃程龔元元汪超祁勇剛張亮子
        中國(guó)調(diào)味品 2022年1期
        關(guān)鍵詞:納豆食醋麩皮

        董紅兵,蔡凱,黃程,龔元元,汪超,祁勇剛,張亮子*

        (1.武漢商學(xué)院 食品科技學(xué)院,武漢 430056;2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,武漢 430068;3.武漢一元堂生物科技股份有限公司,武漢 430223)

        阿魏酸(ferulic acid),簡(jiǎn)稱FA,其化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸,是一種酚酸,它常存在于植物細(xì)胞壁中,如當(dāng)歸、川穹、蒲公英、小麥麩皮、玉米皮等,與木質(zhì)素、多糖交聯(lián)形成復(fù)雜化合物,其具有良好的耐熱、耐酸性,對(duì)光敏感,見(jiàn)光易分解轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。阿魏酸具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抑菌消炎、預(yù)防癌癥和抗突變等多種作用[1-8]。劉麗萍[9]采用1%的氫氧化鈉溶液分別提取了玉米面和玉米皮中的阿魏酸,并用HPLC進(jìn)行了分離測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其阿魏酸含量分別約為1%和4%~5%;歐仕益等[10]采用0.5%的氫氧化鈉溶液能快速使麥麩中大部分阿魏酸游離出來(lái);Faulds C B等[11]選用木聚糖酶和阿魏酸酯酶協(xié)同酶解小麥麩皮,發(fā)現(xiàn)可以有效打破細(xì)胞壁多糖結(jié)構(gòu),顯著提高阿魏酸的提取效率;Hoa T T等[12]選用超聲波輔助堿解法提取谷糠中阿魏酸取得較佳效果;Sun等[13]采用超聲波溶劑法提取了川穹中的阿魏酸,發(fā)現(xiàn)以乙醇為溶劑,超聲波提取效率顯著優(yōu)于堿提法;Grabber J H等[14]采用組織培養(yǎng)獲得了較高含量的阿魏酸衍生物。

        老陳醋,是以高粱為主要原料,以谷糠和麩皮為輔料,大曲為糖化發(fā)酵劑,經(jīng)糖化酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵,再經(jīng)熏醅、陳釀等工藝釀造而成的傳統(tǒng)固態(tài)食醋,老陳醋工藝也在我國(guó)北方其他地方被推廣,而根據(jù)地方谷物資源,原料可選用玉米、小米、麩皮、大米等來(lái)釀造。對(duì)老陳醋中有機(jī)酸的研究較多,而很少涉及阿魏酸,弓曉艷[15]以山西老陳醋為研究對(duì)象,探究了老陳醋的微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)包括乳酸菌、醋酸菌、各種芽孢桿菌等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;蘇靜[16]研究了老陳醋中多酚類物質(zhì)及其抗氧化活性;王元太等[17]研究了老陳醋中除了乙酸和乳酸外α-酮戊二酸、蘋果酸及琥珀酸含量較高,特別是琥珀酸高達(dá)0.787 mg/mL,正是由于多種不揮發(fā)酸的協(xié)同作用才使山西老陳醋的酸味醇厚綿長(zhǎng)、柔和可口;劉凱鳳等[18]從老陳醋中分離3種產(chǎn)酸菌,包括巴氏醋桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌,其中枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生乙酸和琥珀酸,還產(chǎn)生了乙偶姻和3種吡嗪類物質(zhì)。

        有學(xué)者對(duì)食醋中阿魏酸的菌種、轉(zhuǎn)化、功能進(jìn)行了研究[19-24],代謝產(chǎn)生阿魏酸的一般為煙曲霉、黑曲霉。實(shí)驗(yàn)在納豆發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)納豆枯草芽孢桿菌具有代謝產(chǎn)生阿魏酸的酶系,因此將其用于老陳醋中,研究其對(duì)老陳醋原料玉米、麩皮和谷糠等的酶解作用,以期提升老陳醋中阿魏酸的含量,為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        玉米、麩皮、谷糠、大曲、特級(jí)老陳醋:由湖北建始天龍實(shí)業(yè)有限公司提供。

        氯化鈉、蛋白胨、酵母膏、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸:均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        納豆枯草芽孢桿菌(菌種編號(hào):WBUSPN02):實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

        液體培養(yǎng)基:1% NaCl、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、100 mL去離子水,121 ℃滅菌15 min。

        1.2 儀器設(shè)備

        PC-420磁力恒溫?cái)嚢杵?美國(guó)Corning公司;HRN32手持折射儀 德國(guó)托摩根公司;SW-CJ-2D凈化工作臺(tái) 廣州瑞智科學(xué)儀器有限公司;LHS-250SC型智能恒溫恒濕箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;SLY-2112B型大型立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司;YM系列A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;QDWZⅠ3000-7D濕法粉碎機(jī) 無(wú)錫輕大食品有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 老陳醋工藝流程

        1.3.2 操作要點(diǎn)

        取5 kg玉米,粉碎至通過(guò)100目篩的質(zhì)量比為1∶1;取3.2 kg大曲,粉碎至能通過(guò)200目篩。

        潤(rùn)水蒸熟后的高粱,混合大曲,攪拌均勻,入缸,20 ℃保溫4 h,進(jìn)入糖化和酒精發(fā)酵,每天攪拌1次,發(fā)酵5 d至酒精度不再上升,封缸發(fā)酵10 d。

        取谷殼12 kg谷糠和6 kg麩皮,與上述制備的酒醪混合均勻,敞口放置6 h,接種0.5 kg醋化醅,開(kāi)始醋酸發(fā)酵,每天翻拌1次,至第8天時(shí)總酸不再升高,加食鹽封醅。

        1.3.3 不同發(fā)酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸含量的影響

        在老陳醋糖化和酒精發(fā)酵、封缸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵過(guò)程中都有微生物的作用,利用微生物代謝酶系和自身代謝機(jī)制,將原料的各種成分代謝為葡萄糖、乙醇、乙酸、乳酸等營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì),包括阿魏酸的代謝形成。分別在糖化酒精發(fā)酵階段的第1天、第3天,封缸發(fā)酵的第1天、第4天,醋酸發(fā)酵的第1,3,5,7天時(shí)加入玉米和大曲總質(zhì)量6.0%的納豆枯草芽孢桿菌,取醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí),測(cè)定醋醅的阿魏酸和總酸含量,以不接種納豆枯草芽孢桿菌作對(duì)照,每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

        1.3.4 菌種不同接種量對(duì)阿魏酸含量的影響

        在傳統(tǒng)老陳醋釀造過(guò)程中分離得到多種芽孢桿菌,而這些芽孢菌是食醋風(fēng)味形成的重要菌群,接種強(qiáng)化菌劑可能會(huì)對(duì)老陳醋發(fā)酵菌群產(chǎn)生影響,自然會(huì)影響阿魏酸的代謝。根據(jù)1.3.3中阿魏酸含量的結(jié)果確定接種時(shí)間,納豆枯草芽孢桿菌接種量分別設(shè)置為0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%和8.0%,醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí),測(cè)定醋醅的阿魏酸和總酸含量,每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

        1.3.5 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        取玉米50 g,粉碎至通過(guò)200目篩,加水200 g,115 ℃滅菌20 min,接種玉米漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液,置于轉(zhuǎn)速100 r/min、36 ℃的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72 h,分別取發(fā)酵0,6,12,18,24,30,36 h的發(fā)酵液,測(cè)定阿魏酸的含量,做4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

        1.3.6 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        取麩皮50 g,粉碎至通過(guò)200目篩,加水200 g,115 ℃滅菌20 min,接種麩皮漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液,置于轉(zhuǎn)速100 r/min、36 ℃的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72 h,分別取發(fā)酵0,6,12,18,24,30,36 h的發(fā)酵液,測(cè)定阿魏酸的含量,做4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

        1.3.7 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        取谷糠50 g,粉碎至通過(guò)200目篩,加水200 g,115 ℃滅菌20 min,接種谷糠漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液,置于轉(zhuǎn)速100 r/min、36 ℃的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72 h,分別取發(fā)酵0,6,12,18,24,30,36 h的發(fā)酵液,測(cè)定阿魏酸的含量,做4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

        1.3.8 食醋質(zhì)量評(píng)價(jià)

        以1.3.4研究的納豆枯草芽孢桿菌種子液添加時(shí)間和添加量按照1.3.1的老陳醋工藝流程制備老陳醋,測(cè)定總酸、不揮發(fā)酸、可溶性無(wú)鹽固形物和阿魏酸等理化指標(biāo),以不添加納豆枯草芽孢桿菌制備的老陳醋為對(duì)照,對(duì)老陳醋進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

        1.4 指標(biāo)測(cè)定

        1.4.1 阿魏酸的測(cè)定

        參照何粉霞[25]關(guān)于阿魏酸的測(cè)定方法,并做適當(dāng)優(yōu)化。取醋醅,壓榨取醋汁,或發(fā)酵漿液過(guò)濾后,5000 r/min離心,取上清液10 mL,加入6 mL乙酸乙酯萃取,重復(fù)3次,取乙酸乙酯層,合并萃取液,旋轉(zhuǎn)蒸干,得到阿魏酸粗品。用4 mL無(wú)水乙醇溶解,于286 nm下測(cè)定其吸收值,每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

        1.4.2 總酸、不揮發(fā)酸、可溶性無(wú)鹽固形物的測(cè)定

        參考GB 18187-2000《釀造食醋》中規(guī)定的方法測(cè)定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同發(fā)酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸含量的影響

        食醋是一種通過(guò)多菌系相互拮抗、多階段的復(fù)雜發(fā)酵過(guò)程獲得的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品,其原料涉及到多種谷物及其加工副產(chǎn)物,營(yíng)養(yǎng)成分豐富而復(fù)雜,基于研究阿魏酸的變化,添加微生物強(qiáng)化菌劑,同時(shí)也可能會(huì)影響食醋發(fā)酵進(jìn)程,進(jìn)而影響食醋的感官和理化指標(biāo)。由于食醋在糖化酒精發(fā)酵、封缸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵中都有微生物的代謝活動(dòng),因此選擇在這些發(fā)酵過(guò)程中添加納豆菌,研究其對(duì)食醋的影響,見(jiàn)圖1。

        圖1 不同發(fā)酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對(duì)醋汁阿魏酸和總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculating Bacillus subtilis natto in different fermentation stages on ferulic acid and total acid content of vinegar juice

        由圖1可知,在糖化酒精發(fā)酵起始或初期加入納豆枯草芽孢桿菌,醋汁的阿魏酸含量分別達(dá)到了60.16,59.28 mg/L,在醋酸發(fā)酵階段加入,則對(duì)阿魏酸含量的提升不如糖化階段顯著,僅為36.59 mg/L,且添加時(shí)間越晚,阿魏酸含量越小,但比在封缸發(fā)酵階段添加效果仍明顯好。在糖化和醋酸發(fā)酵起始時(shí)添加,會(huì)顯著降低醋汁的總酸含量,使總酸下降約1.2 g/dL,嚴(yán)重影響原料利用率,可能是此時(shí)添加會(huì)影響其他微生物增殖,進(jìn)而影響食醋發(fā)酵進(jìn)程,因此選擇在糖化酒精發(fā)酵第3天添加納豆枯草芽孢桿菌較適宜。

        2.2 菌種不同接種量對(duì)阿魏酸含量影響

        食醋發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)霉菌、酵母、細(xì)菌等幾十種甚至上百種菌株受營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)條件影響,而此消彼長(zhǎng)、相互影響的復(fù)雜發(fā)酵體系,而納豆枯草芽孢桿菌是一種好氧菌,繁殖和適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng),添加至發(fā)酵中的菌落數(shù)可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)抑制其他菌落的增殖與代謝。

        由圖2可知,在糖化酒精發(fā)酵第3天添加納豆枯草芽孢桿菌,隨著接種量的增大,阿魏酸含量先快速上升至59.36 mg/L,而后增長(zhǎng)緩慢趨于穩(wěn)定,而總酸隨著接種量的增大較穩(wěn)定,但增至5.0%以后顯著下降,可能是接種量過(guò)大打破了糖化酒精發(fā)酵過(guò)程的菌群平衡,影響了發(fā)酵進(jìn)程,降低了原料利用率,因此接種量為5.0%時(shí)較合適。

        圖2 納豆枯草芽孢桿菌不同接種量對(duì)醋汁阿魏酸和總酸含量的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount of Bacillus subtilis natto on ferulic acid and total acid content in vinegar juice

        2.3 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        玉米作為三大主糧之一,也是釀造食醋的主要原料,劉麗萍以玉米研究對(duì)象,探究了玉米中阿魏酸的含量,通過(guò)加強(qiáng)堿水解,發(fā)現(xiàn)玉米面中含有較高含量的阿魏酸,而玉米麩皮中含量更高,可達(dá)5%。

        由圖3可知,將玉米粉碎,高溫蒸煮后接種納豆枯草芽孢桿菌,阿魏酸隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先緩慢增加后顯著增加,至24 h時(shí)達(dá)到3.729 g/L,而后緩慢減小。接種后,菌株快速增殖,代謝分泌酶系酶解玉米營(yíng)養(yǎng)成分,產(chǎn)生阿魏酸,當(dāng)阿魏酸增至最高時(shí),可能菌株又分泌酶解阿魏酸的酶,使之又緩慢減少。

        圖3 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響Fig.3 Effect of maize inoculated with Bacillus subtilis natto on ferulic acid content

        2.4 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        麩皮是固態(tài)食醋釀造中一種重要的輔料,也是制作大曲的原料,同時(shí)其含有較高的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分,也被微生物利用,張欣等綜述了含有阿魏酸的主要原料,包括麩皮、玉米、谷殼等。

        由圖4可知,發(fā)酵麩皮漿液的阿魏酸含量與玉米漿液變化趨勢(shì)一致,但發(fā)酵至24 h時(shí),阿魏酸含量?jī)H為1.018 g/L,為玉米漿液的27.29%,顯著低于玉米漿液的含量,由于玉米和麩皮的粒徑一樣小,因此,可以推測(cè)麩皮的阿魏酸含量遠(yuǎn)低于玉米。

        圖4 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        2.5 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        谷糠也是固態(tài)食醋釀造的重要輔料,其起著疏松醋醅、供給氧氣、利于物質(zhì)和熱量交換的作用,對(duì)食醋醋酸發(fā)酵成敗至關(guān)重要。谷糠與玉米、麩皮在質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)成分上的較大的區(qū)別,其主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,在醋酸發(fā)酵時(shí)其不高溫蒸煮,且整粒使用不粉碎。

        圖5對(duì)比了整粒和粉碎谷糠漿液發(fā)酵過(guò)程中阿魏酸含量的變化,其中粉碎谷糠漿液的阿魏酸變化趨勢(shì)與玉米、麩皮漿液一致,發(fā)酵24 h時(shí)阿魏酸含量最高,達(dá)到0.661 g/L,僅為玉米漿液的17.72%,而不粉碎的谷糠在發(fā)酵6 h后才檢測(cè)到且增長(zhǎng)緩慢,至36 h時(shí)其含量為0.087 g/L,僅為粉碎谷糠發(fā)酵24 h的13.16%。對(duì)比接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)玉米、麩皮和谷糠中阿魏酸含量的影響,由于醋酸發(fā)酵時(shí)谷糠不蒸煮、不粉碎,因此,醋汁中阿魏酸的含量主要來(lái)源于納豆枯草芽孢桿菌對(duì)玉米、麩皮的酶解產(chǎn)生。

        圖5 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

        2.6 老陳醋質(zhì)量評(píng)價(jià)

        以玉米為原料,采用老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝,在糖化酒精發(fā)酵第3天添加玉米和大曲總質(zhì)量5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液,釀造老陳醋,黑褐色、體態(tài)黏稠、酯香濃郁,總酸為6.16 g/dL,阿魏酸含量為32.45 mg/L,實(shí)驗(yàn)制備的老陳醋與不添加納豆枯草芽孢桿菌釀造的老陳醋、以高粱為原料釀造的特級(jí)老陳醋相比,理化指標(biāo)見(jiàn)表1。

        表1 老陳醋理化指標(biāo)Table 1 The physicochemical indexes of aged vinegar

        由表1可知,總酸、不揮發(fā)酸、可溶性無(wú)鹽固形物差異不顯著,而添加種子液,阿魏酸含量是對(duì)照組的3.7倍,是高粱特級(jí)老陳醋的近10倍。添加納豆枯草芽孢桿菌種子液作為強(qiáng)化菌劑,在不影響老陳醋整體品質(zhì)的基礎(chǔ)上,提高了以玉米為原料的老陳醋阿魏酸的含量,提升了老陳醋功能性,同時(shí)提高了原料利用率和產(chǎn)品附加值。

        3 結(jié)論

        將納豆發(fā)酵用菌種納豆枯草芽孢桿菌用于提高老陳醋中阿魏酸含量。通過(guò)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在糖化酒精發(fā)酵開(kāi)始的第3天添加5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液,醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)醋汁中阿魏酸含量高達(dá)59.36 mg/L。而在糖化酒精發(fā)酵第1天添加,雖然阿魏酸含量更高,但會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制原有菌群的增殖和代謝,使總酸含量顯著降低,進(jìn)而影響原料的轉(zhuǎn)化率;封缸發(fā)酵時(shí)添加,阿魏酸含量增加不顯著,可能是此時(shí)封缸發(fā)酵為厭氧發(fā)酵,納豆枯草芽孢桿菌不增殖,或菌體直接自溶,在后期醋酸發(fā)酵菌落數(shù)也較少,效果不佳;醋酸發(fā)酵起始時(shí)添加,阿魏酸可達(dá)36.59 mg/L,添加時(shí)間越晚,其含量越小,可能是納豆枯草芽孢桿菌受到醋酸菌的競(jìng)爭(zhēng)抑制和高濃度醋酸的脅迫,影響其增殖與代謝。

        食醋中的3種原輔料玉米、麩皮和谷糠經(jīng)粉碎、打漿、115 ℃滅菌后,分別接種納豆枯草芽孢桿菌,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),阿魏酸含量均是先顯著增大而后緩慢減小,均在24 h時(shí)達(dá)到最大值,分別為3.729,1.018,0.661 g/L,因此,納豆枯草芽孢桿菌可能是代謝相關(guān)酶系降解原料中的阿魏酸酯生成阿魏酸,當(dāng)阿魏酸酯含量極低時(shí),菌株代謝酶解阿魏酸的酶系,使阿魏酸進(jìn)一步酶解而含量緩慢減小。谷糠不粉碎時(shí),阿魏酸緩慢增加,至36 h時(shí)其含量為0.087 g/L,僅為粉碎谷糠發(fā)酵24 h的13.16%,由于食醋釀造時(shí),谷殼不粉碎、不高溫加熱,因此醋汁中阿魏酸主要來(lái)源于玉米和麩皮。

        以玉米為原料,采用老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝,在糖化酒精發(fā)酵第3天添加玉米和大曲總質(zhì)量5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液,釀造的老陳醋,酯香濃郁,總酸為6.16 g/dL,阿魏酸含量為32.45 mg/L,其阿魏酸含量是不添加種子液的3.7倍、高粱特級(jí)老陳醋的近10倍,添加納豆枯草芽孢桿菌種子液作為強(qiáng)化菌劑,在不影響老陳醋整體品質(zhì)的基礎(chǔ)上,提高了以玉米為原料的老陳醋的阿魏酸含量,提升了老陳醋的功能性,為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

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