董紅兵,蔡凱,黃程,龔元元,汪超,祁勇剛,張亮子*

(1.武漢商學(xué)院 食品科技學(xué)院，武漢 430056；2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068；3.武漢一元堂生物科技股份有限公司，武漢 430223)

阿魏酸(ferulic acid)，簡(jiǎn)稱FA，其化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是一種酚酸，它常存在于植物細(xì)胞壁中，如當(dāng)歸、川穹、蒲公英、小麥麩皮、玉米皮等，與木質(zhì)素、多糖交聯(lián)形成復(fù)雜化合物，其具有良好的耐熱、耐酸性，對(duì)光敏感，見(jiàn)光易分解轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。阿魏酸具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抑菌消炎、預(yù)防癌癥和抗突變等多種作用[1-8]。劉麗萍[9]采用1%的氫氧化鈉溶液分別提取了玉米面和玉米皮中的阿魏酸，并用HPLC進(jìn)行了分離測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其阿魏酸含量分別約為1%和4%～5%；歐仕益等[10]采用0.5%的氫氧化鈉溶液能快速使麥麩中大部分阿魏酸游離出來(lái)；Faulds C B等[11]選用木聚糖酶和阿魏酸酯酶協(xié)同酶解小麥麩皮，發(fā)現(xiàn)可以有效打破細(xì)胞壁多糖結(jié)構(gòu)，顯著提高阿魏酸的提取效率；Hoa T T等[12]選用超聲波輔助堿解法提取谷糠中阿魏酸取得較佳效果；Sun等[13]采用超聲波溶劑法提取了川穹中的阿魏酸，發(fā)現(xiàn)以乙醇為溶劑，超聲波提取效率顯著優(yōu)于堿提法；Grabber J H等[14]采用組織培養(yǎng)獲得了較高含量的阿魏酸衍生物。

老陳醋，是以高粱為主要原料，以谷糠和麩皮為輔料，大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)糖化酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵，再經(jīng)熏醅、陳釀等工藝釀造而成的傳統(tǒng)固態(tài)食醋，老陳醋工藝也在我國(guó)北方其他地方被推廣，而根據(jù)地方谷物資源，原料可選用玉米、小米、麩皮、大米等來(lái)釀造。對(duì)老陳醋中有機(jī)酸的研究較多，而很少涉及阿魏酸，弓曉艷[15]以山西老陳醋為研究對(duì)象，探究了老陳醋的微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)包括乳酸菌、醋酸菌、各種芽孢桿菌等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；蘇靜[16]研究了老陳醋中多酚類物質(zhì)及其抗氧化活性；王元太等[17]研究了老陳醋中除了乙酸和乳酸外α-酮戊二酸、蘋果酸及琥珀酸含量較高，特別是琥珀酸高達(dá)0.787 mg/mL，正是由于多種不揮發(fā)酸的協(xié)同作用才使山西老陳醋的酸味醇厚綿長(zhǎng)、柔和可口；劉凱鳳等[18]從老陳醋中分離3種產(chǎn)酸菌，包括巴氏醋桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌，其中枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生乙酸和琥珀酸，還產(chǎn)生了乙偶姻和3種吡嗪類物質(zhì)。

有學(xué)者對(duì)食醋中阿魏酸的菌種、轉(zhuǎn)化、功能進(jìn)行了研究[19-24]，代謝產(chǎn)生阿魏酸的一般為煙曲霉、黑曲霉。實(shí)驗(yàn)在納豆發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)納豆枯草芽孢桿菌具有代謝產(chǎn)生阿魏酸的酶系，因此將其用于老陳醋中，研究其對(duì)老陳醋原料玉米、麩皮和谷糠等的酶解作用，以期提升老陳醋中阿魏酸的含量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米、麩皮、谷糠、大曲、特級(jí)老陳醋：由湖北建始天龍實(shí)業(yè)有限公司提供。

氯化鈉、蛋白胨、酵母膏、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

納豆枯草芽孢桿菌(菌種編號(hào)：WBUSPN02)：實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

液體培養(yǎng)基：1% NaCl、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、100 mL去離子水，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器設(shè)備

PC-420磁力恒溫?cái)嚢杵?美國(guó)Corning公司；HRN32手持折射儀 德國(guó)托摩根公司；SW-CJ-2D凈化工作臺(tái) 廣州瑞智科學(xué)儀器有限公司；LHS-250SC型智能恒溫恒濕箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SLY-2112B型大型立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；YM系列A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；QDWZⅠ3000-7D濕法粉碎機(jī) 無(wú)錫輕大食品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 老陳醋工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

取5 kg玉米，粉碎至通過(guò)100目篩的質(zhì)量比為1∶1；取3.2 kg大曲，粉碎至能通過(guò)200目篩。

潤(rùn)水蒸熟后的高粱，混合大曲，攪拌均勻，入缸，20 ℃保溫4 h，進(jìn)入糖化和酒精發(fā)酵，每天攪拌1次，發(fā)酵5 d至酒精度不再上升，封缸發(fā)酵10 d。

取谷殼12 kg谷糠和6 kg麩皮，與上述制備的酒醪混合均勻，敞口放置6 h，接種0.5 kg醋化醅，開(kāi)始醋酸發(fā)酵，每天翻拌1次，至第8天時(shí)總酸不再升高，加食鹽封醅。

1.3.3 不同發(fā)酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸含量的影響

在老陳醋糖化和酒精發(fā)酵、封缸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵過(guò)程中都有微生物的作用，利用微生物代謝酶系和自身代謝機(jī)制，將原料的各種成分代謝為葡萄糖、乙醇、乙酸、乳酸等營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)，包括阿魏酸的代謝形成。分別在糖化酒精發(fā)酵階段的第1天、第3天，封缸發(fā)酵的第1天、第4天，醋酸發(fā)酵的第1，3，5，7天時(shí)加入玉米和大曲總質(zhì)量6.0%的納豆枯草芽孢桿菌，取醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定醋醅的阿魏酸和總酸含量，以不接種納豆枯草芽孢桿菌作對(duì)照，每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 菌種不同接種量對(duì)阿魏酸含量的影響

在傳統(tǒng)老陳醋釀造過(guò)程中分離得到多種芽孢桿菌，而這些芽孢菌是食醋風(fēng)味形成的重要菌群，接種強(qiáng)化菌劑可能會(huì)對(duì)老陳醋發(fā)酵菌群產(chǎn)生影響，自然會(huì)影響阿魏酸的代謝。根據(jù)1.3.3中阿魏酸含量的結(jié)果確定接種時(shí)間，納豆枯草芽孢桿菌接種量分別設(shè)置為0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%和8.0%，醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定醋醅的阿魏酸和總酸含量，每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

取玉米50 g，粉碎至通過(guò)200目篩，加水200 g，115 ℃滅菌20 min，接種玉米漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液，置于轉(zhuǎn)速100 r/min、36 ℃的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72 h，分別取發(fā)酵0，6，12，18，24，30，36 h的發(fā)酵液，測(cè)定阿魏酸的含量，做4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

取麩皮50 g，粉碎至通過(guò)200目篩，加水200 g，115 ℃滅菌20 min，接種麩皮漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液，置于轉(zhuǎn)速100 r/min、36 ℃的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72 h，分別取發(fā)酵0，6，12，18，24，30，36 h的發(fā)酵液，測(cè)定阿魏酸的含量，做4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

取谷糠50 g，粉碎至通過(guò)200目篩，加水200 g，115 ℃滅菌20 min，接種谷糠漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液，置于轉(zhuǎn)速100 r/min、36 ℃的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72 h，分別取發(fā)酵0，6，12，18，24，30，36 h的發(fā)酵液，測(cè)定阿魏酸的含量，做4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 食醋質(zhì)量評(píng)價(jià)

以1.3.4研究的納豆枯草芽孢桿菌種子液添加時(shí)間和添加量按照1.3.1的老陳醋工藝流程制備老陳醋，測(cè)定總酸、不揮發(fā)酸、可溶性無(wú)鹽固形物和阿魏酸等理化指標(biāo)，以不添加納豆枯草芽孢桿菌制備的老陳醋為對(duì)照，對(duì)老陳醋進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 阿魏酸的測(cè)定

參照何粉霞[25]關(guān)于阿魏酸的測(cè)定方法，并做適當(dāng)優(yōu)化。取醋醅，壓榨取醋汁，或發(fā)酵漿液過(guò)濾后，5000 r/min離心，取上清液10 mL，加入6 mL乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次，取乙酸乙酯層，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到阿魏酸粗品。用4 mL無(wú)水乙醇溶解，于286 nm下測(cè)定其吸收值，每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 總酸、不揮發(fā)酸、可溶性無(wú)鹽固形物的測(cè)定

參考GB 18187-2000《釀造食醋》中規(guī)定的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸含量的影響

食醋是一種通過(guò)多菌系相互拮抗、多階段的復(fù)雜發(fā)酵過(guò)程獲得的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，其原料涉及到多種谷物及其加工副產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)成分豐富而復(fù)雜，基于研究阿魏酸的變化，添加微生物強(qiáng)化菌劑，同時(shí)也可能會(huì)影響食醋發(fā)酵進(jìn)程，進(jìn)而影響食醋的感官和理化指標(biāo)。由于食醋在糖化酒精發(fā)酵、封缸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵中都有微生物的代謝活動(dòng)，因此選擇在這些發(fā)酵過(guò)程中添加納豆菌，研究其對(duì)食醋的影響，見(jiàn)圖1。

圖1 不同發(fā)酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對(duì)醋汁阿魏酸和總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculating Bacillus subtilis natto in different fermentation stages on ferulic acid and total acid content of vinegar juice

由圖1可知，在糖化酒精發(fā)酵起始或初期加入納豆枯草芽孢桿菌，醋汁的阿魏酸含量分別達(dá)到了60.16，59.28 mg/L，在醋酸發(fā)酵階段加入，則對(duì)阿魏酸含量的提升不如糖化階段顯著，僅為36.59 mg/L，且添加時(shí)間越晚，阿魏酸含量越小，但比在封缸發(fā)酵階段添加效果仍明顯好。在糖化和醋酸發(fā)酵起始時(shí)添加，會(huì)顯著降低醋汁的總酸含量，使總酸下降約1.2 g/dL，嚴(yán)重影響原料利用率，可能是此時(shí)添加會(huì)影響其他微生物增殖，進(jìn)而影響食醋發(fā)酵進(jìn)程，因此選擇在糖化酒精發(fā)酵第3天添加納豆枯草芽孢桿菌較適宜。

2.2 菌種不同接種量對(duì)阿魏酸含量影響

食醋發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)霉菌、酵母、細(xì)菌等幾十種甚至上百種菌株受營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)條件影響，而此消彼長(zhǎng)、相互影響的復(fù)雜發(fā)酵體系，而納豆枯草芽孢桿菌是一種好氧菌，繁殖和適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，添加至發(fā)酵中的菌落數(shù)可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)抑制其他菌落的增殖與代謝。

由圖2可知，在糖化酒精發(fā)酵第3天添加納豆枯草芽孢桿菌，隨著接種量的增大，阿魏酸含量先快速上升至59.36 mg/L，而后增長(zhǎng)緩慢趨于穩(wěn)定，而總酸隨著接種量的增大較穩(wěn)定，但增至5.0%以后顯著下降，可能是接種量過(guò)大打破了糖化酒精發(fā)酵過(guò)程的菌群平衡，影響了發(fā)酵進(jìn)程，降低了原料利用率，因此接種量為5.0%時(shí)較合適。

圖2 納豆枯草芽孢桿菌不同接種量對(duì)醋汁阿魏酸和總酸含量的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount of Bacillus subtilis natto on ferulic acid and total acid content in vinegar juice

2.3 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

玉米作為三大主糧之一，也是釀造食醋的主要原料，劉麗萍以玉米研究對(duì)象，探究了玉米中阿魏酸的含量，通過(guò)加強(qiáng)堿水解，發(fā)現(xiàn)玉米面中含有較高含量的阿魏酸，而玉米麩皮中含量更高，可達(dá)5%。

由圖3可知，將玉米粉碎，高溫蒸煮后接種納豆枯草芽孢桿菌，阿魏酸隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先緩慢增加后顯著增加，至24 h時(shí)達(dá)到3.729 g/L，而后緩慢減小。接種后，菌株快速增殖，代謝分泌酶系酶解玉米營(yíng)養(yǎng)成分，產(chǎn)生阿魏酸，當(dāng)阿魏酸增至最高時(shí)，可能菌株又分泌酶解阿魏酸的酶，使之又緩慢減少。

圖3 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響Fig.3 Effect of maize inoculated with Bacillus subtilis natto on ferulic acid content

2.4 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

麩皮是固態(tài)食醋釀造中一種重要的輔料，也是制作大曲的原料，同時(shí)其含有較高的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分，也被微生物利用，張欣等綜述了含有阿魏酸的主要原料，包括麩皮、玉米、谷殼等。

由圖4可知，發(fā)酵麩皮漿液的阿魏酸含量與玉米漿液變化趨勢(shì)一致，但發(fā)酵至24 h時(shí)，阿魏酸含量?jī)H為1.018 g/L，為玉米漿液的27.29%,顯著低于玉米漿液的含量，由于玉米和麩皮的粒徑一樣小，因此，可以推測(cè)麩皮的阿魏酸含量遠(yuǎn)低于玉米。

圖4 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

2.5 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

谷糠也是固態(tài)食醋釀造的重要輔料，其起著疏松醋醅、供給氧氣、利于物質(zhì)和熱量交換的作用，對(duì)食醋醋酸發(fā)酵成敗至關(guān)重要。谷糠與玉米、麩皮在質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)成分上的較大的區(qū)別，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，在醋酸發(fā)酵時(shí)其不高溫蒸煮，且整粒使用不粉碎。

圖5對(duì)比了整粒和粉碎谷糠漿液發(fā)酵過(guò)程中阿魏酸含量的變化，其中粉碎谷糠漿液的阿魏酸變化趨勢(shì)與玉米、麩皮漿液一致，發(fā)酵24 h時(shí)阿魏酸含量最高，達(dá)到0.661 g/L，僅為玉米漿液的17.72%，而不粉碎的谷糠在發(fā)酵6 h后才檢測(cè)到且增長(zhǎng)緩慢，至36 h時(shí)其含量為0.087 g/L，僅為粉碎谷糠發(fā)酵24 h的13.16%。對(duì)比接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)玉米、麩皮和谷糠中阿魏酸含量的影響，由于醋酸發(fā)酵時(shí)谷糠不蒸煮、不粉碎，因此，醋汁中阿魏酸的含量主要來(lái)源于納豆枯草芽孢桿菌對(duì)玉米、麩皮的酶解產(chǎn)生。

圖5 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對(duì)阿魏酸的影響

2.6 老陳醋質(zhì)量評(píng)價(jià)

以玉米為原料，采用老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝，在糖化酒精發(fā)酵第3天添加玉米和大曲總質(zhì)量5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液，釀造老陳醋，黑褐色、體態(tài)黏稠、酯香濃郁，總酸為6.16 g/dL，阿魏酸含量為32.45 mg/L，實(shí)驗(yàn)制備的老陳醋與不添加納豆枯草芽孢桿菌釀造的老陳醋、以高粱為原料釀造的特級(jí)老陳醋相比，理化指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 老陳醋理化指標(biāo)Table 1 The physicochemical indexes of aged vinegar

由表1可知，總酸、不揮發(fā)酸、可溶性無(wú)鹽固形物差異不顯著，而添加種子液，阿魏酸含量是對(duì)照組的3.7倍，是高粱特級(jí)老陳醋的近10倍。添加納豆枯草芽孢桿菌種子液作為強(qiáng)化菌劑，在不影響老陳醋整體品質(zhì)的基礎(chǔ)上，提高了以玉米為原料的老陳醋阿魏酸的含量，提升了老陳醋功能性，同時(shí)提高了原料利用率和產(chǎn)品附加值。

3 結(jié)論

將納豆發(fā)酵用菌種納豆枯草芽孢桿菌用于提高老陳醋中阿魏酸含量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在糖化酒精發(fā)酵開(kāi)始的第3天添加5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液，醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)醋汁中阿魏酸含量高達(dá)59.36 mg/L。而在糖化酒精發(fā)酵第1天添加，雖然阿魏酸含量更高，但會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制原有菌群的增殖和代謝，使總酸含量顯著降低，進(jìn)而影響原料的轉(zhuǎn)化率；封缸發(fā)酵時(shí)添加，阿魏酸含量增加不顯著，可能是此時(shí)封缸發(fā)酵為厭氧發(fā)酵，納豆枯草芽孢桿菌不增殖，或菌體直接自溶，在后期醋酸發(fā)酵菌落數(shù)也較少，效果不佳；醋酸發(fā)酵起始時(shí)添加，阿魏酸可達(dá)36.59 mg/L，添加時(shí)間越晚，其含量越小，可能是納豆枯草芽孢桿菌受到醋酸菌的競(jìng)爭(zhēng)抑制和高濃度醋酸的脅迫，影響其增殖與代謝。

食醋中的3種原輔料玉米、麩皮和谷糠經(jīng)粉碎、打漿、115 ℃滅菌后，分別接種納豆枯草芽孢桿菌，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，阿魏酸含量均是先顯著增大而后緩慢減小，均在24 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為3.729，1.018，0.661 g/L，因此，納豆枯草芽孢桿菌可能是代謝相關(guān)酶系降解原料中的阿魏酸酯生成阿魏酸，當(dāng)阿魏酸酯含量極低時(shí)，菌株代謝酶解阿魏酸的酶系，使阿魏酸進(jìn)一步酶解而含量緩慢減小。谷糠不粉碎時(shí)，阿魏酸緩慢增加，至36 h時(shí)其含量為0.087 g/L，僅為粉碎谷糠發(fā)酵24 h的13.16%，由于食醋釀造時(shí)，谷殼不粉碎、不高溫加熱，因此醋汁中阿魏酸主要來(lái)源于玉米和麩皮。

以玉米為原料，采用老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝，在糖化酒精發(fā)酵第3天添加玉米和大曲總質(zhì)量5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液，釀造的老陳醋，酯香濃郁，總酸為6.16 g/dL，阿魏酸含量為32.45 mg/L，其阿魏酸含量是不添加種子液的3.7倍、高粱特級(jí)老陳醋的近10倍，添加納豆枯草芽孢桿菌種子液作為強(qiáng)化菌劑，在不影響老陳醋整體品質(zhì)的基礎(chǔ)上，提高了以玉米為原料的老陳醋的阿魏酸含量，提升了老陳醋的功能性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。