宋慶蕊，王潤楊，劉濱磊*

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.武漢濱會(huì)生物科技股份有限公司)

癌癥是全球第一大死亡原因，已經(jīng)嚴(yán)重影響到人類的生活[1]。其中，結(jié)直腸癌更是消化道常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居全球腫瘤發(fā)病第3位，死亡率居腫瘤致死病因的第2位[2]。溶瘤病毒(oncolytic virus)能夠特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并引起細(xì)胞病理效應(yīng)和機(jī)體免疫反應(yīng)，造成腫瘤細(xì)胞裂解[3]。

oHSV2是一種Ⅱ型單純皰疹病毒，其在標(biāo)準(zhǔn)株HSV-2(HG52)的基礎(chǔ)上，敲除了ICP47基因及ICP34.5基因并插入了粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF)，從而使病毒可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制，促進(jìn)抗原遞呈并且提高了病毒的溶瘤活性[4]。oHSV2具有直接的細(xì)胞毒殺傷作用，可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境并引起宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)，形成免疫記憶從而產(chǎn)生持久的抗腫瘤療效，其藥物安全性評(píng)價(jià)多采用BALB/c小鼠作為動(dòng)物模型，已證實(shí)具有較強(qiáng)的生物安全性[5]。

Fluc是一種較為常用的熒光素酶種類，由于Fluc基因表達(dá)的結(jié)果是產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，因而可以廣泛應(yīng)用于基因檢測，作為一種報(bào)告基因和標(biāo)記基因來研究基因的表達(dá)情況[6]，利用活體成像系統(tǒng)來檢測熒光信號(hào)，此方法反應(yīng)靈敏且易于檢測[7]。實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)完成了表達(dá)FLuc的oHSV2構(gòu)建工作[8]，本研究主要考察oHSV2所攜帶的Fluc是否可以在小鼠皮下進(jìn)行表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

BALB/c小鼠購于湖北省食品藥品安全評(píng)價(jià)中心，CT26細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心惠贈(zèng))。

1.1.2 試劑與儀器

DME/F-12培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自四季青公司；D-Luciferin購自碧云天(Beyotime)公司；PBS緩沖液購自美國Biosharp公司；oHSV2-Fluc(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)。

二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本松下公司；小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購自PE珀金埃爾默股份有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；生物安全柜購自青島海爾集團(tuán)公司；恒溫水浴鍋購自新苗生物科技有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；常溫冰箱購自青島海爾集團(tuán)公司；-70℃低溫冰箱購自青島海爾集團(tuán)公司；倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯Olympus Corporation。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

CT26細(xì)胞由北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心惠贈(zèng)，未檢測出支原體。細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DME/F-12，將細(xì)胞放置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，按照1∶4的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 植瘤前細(xì)胞處理

對(duì)所需要植瘤的CT26細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DME/F-12。在植瘤前，收集細(xì)胞，離心條件為400g×5min，然后重懸于PBS中。調(diào)整CT26細(xì)胞濃度至2×107/mL。

1.2.3 CT26細(xì)胞植瘤

從湖北省食品藥品安全評(píng)價(jià)中心購買20只6～7周齡的雌性BALB/c小鼠(體質(zhì)量16～20g)，飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)(配有IVC籠具及新風(fēng)系統(tǒng))，飼養(yǎng)1周左右，開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取10只植瘤：于BALB/c小鼠右側(cè)肋背部皮下注射100 μL含有2×106個(gè)CT26的細(xì)胞懸液，待腫瘤生長至100mm3備用。

1.2.4 oHSV2-Fluc給藥實(shí)驗(yàn)

分別給CT26荷瘤鼠組及健康BALB/c小鼠組注射100μL不同濃度(105CCID50、106CCID50)的oHSV2-Fluc，CCID50(cell culture infective dose 50%)為細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量，主要用于檢測病毒滴度?？瞻捉M注射100μL PBS/只，故每組采用2只小鼠。實(shí)驗(yàn)分組見表1。

表1 oHSV2-Fluc給藥實(shí)驗(yàn)方案

1.2.5 活體動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測Fluc產(chǎn)生的熒光信號(hào)

用無菌的D-PBS(不含Mg2+和Ca2+)溶解D-Luciferin，配制成15mg/mL的D-螢光素鉀鹽溶液，0.2μM濾膜過濾除菌，混勻后立即分裝在-20℃保存。oHSV2-Fluc能表達(dá)螢火蟲熒光素酶，先注射熒光素酶底物D-螢光素鉀鹽溶液再通過小動(dòng)物活體成像儀可以觀察到熒光信號(hào)。每只BALB/c小鼠腹腔注射D-螢光素鉀鹽溶液200μL，注射入體內(nèi)10～20min后，待熒光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期，再進(jìn)行成像分析。每次拍攝前腹腔注射D-螢光素鉀鹽溶液200μL，10min左右進(jìn)行麻醉，再進(jìn)行熒光拍攝。每隔24h使用小動(dòng)物活體成像儀觀察小鼠體內(nèi)表達(dá)情況，連續(xù)觀察7d。

2 結(jié) 果

2.1 BALB/c小鼠Fluc基因皮下表達(dá)的檢測

使用小動(dòng)物活體成像儀對(duì)BALB/c小鼠體內(nèi)oHSV2所攜帶的Fluc基因進(jìn)行檢測，檢測到給藥后不同天數(shù)的熒光信號(hào)結(jié)果見圖1(封二)。結(jié)果顯示：高劑量給藥的熒光信號(hào)強(qiáng)度高于低劑量給藥的熒光信號(hào)，采用瘤內(nèi)注射方式的熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于同等劑量皮下注射方式的熒光強(qiáng)度。CT26荷瘤鼠空白組和健康小鼠空白組均未檢測出熒光信號(hào)。隨天數(shù)增加，小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度整體減弱，瘤內(nèi)注射小鼠檢測到的熒光信號(hào)在第6d時(shí)接近消失，皮下注射小鼠檢測到的熒光信號(hào)在第3d時(shí)檢測接近消失。熒光信號(hào)均集中在小鼠給藥部位，未分布在其他部位。

2.2 Fluc基因在體內(nèi)表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度及趨勢

檢測到Fluc基因在瘤內(nèi)及皮下表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度見圖2(封二)。結(jié)果表明：檢測到Fluc基因表達(dá)的熒光信號(hào)隨天數(shù)的增多而減弱，在第7d時(shí)，兩種注射方式的小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)均已接近消失。在同等劑量的條件下，第1d的熒光信號(hào)強(qiáng)度均為皮下組強(qiáng)于瘤內(nèi)組，而第1d后均為瘤內(nèi)組強(qiáng)于皮下組?？瞻捉M均未檢測到熒光信號(hào)。

檢測到Fluc基因在瘤內(nèi)表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，在同等劑量的條件下，高劑量給藥的熒光信號(hào)強(qiáng)度高于低劑量給藥的熒光信號(hào)，且高劑量給藥與低劑量給藥檢測到的熒光信號(hào)強(qiáng)度隨天數(shù)增加的變化呈現(xiàn)相似的趨勢。小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度整體呈現(xiàn)下降趨勢，而在第2d時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度有稍增高的趨勢，在第6d時(shí)已接近消失。

檢測到Fluc基因在皮下表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，在同等劑量的條件下，高劑量給藥的熒光信號(hào)強(qiáng)度高于低劑量給藥的熒光信號(hào)，且高劑量給藥與低劑量給藥檢測到的熒光信號(hào)強(qiáng)度隨天數(shù)增加的變化呈現(xiàn)相似的趨勢。小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度整體呈現(xiàn)下降趨勢，在第3d時(shí)已接近消失。

3 討 論

熒光素酶生物發(fā)光報(bào)告體系是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測方法，本研究采用FLuc作為報(bào)告基因，通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測oHSV2-FLuc發(fā)出的熒光信號(hào)，以驗(yàn)證外源基因是否可以在皮下表達(dá)。oHSV2提供了一種治療惡性腫瘤的新型方法，其治療食管癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌已經(jīng)進(jìn)入了Ⅱ期臨床研究[9]。利用oHSV2進(jìn)行腫瘤治療，病毒安全性是一個(gè)非常值得關(guān)注的問題，提高病毒安全性尚需要更全面的研究。

現(xiàn)有的溶瘤病毒的臨床給藥大多數(shù)通過瘤內(nèi)注射進(jìn)行[10]，這給溶瘤病毒的安全性評(píng)價(jià)帶來了極大的挑戰(zhàn)，因?yàn)殡y以尋找完全合適的動(dòng)物及腫瘤模型。食蟹猴具有發(fā)達(dá)的大腦且大腦的一些反應(yīng)與人類比較相似，并且與人類的社會(huì)構(gòu)建較為相像，是一種常用的化學(xué)類藥物安全性評(píng)價(jià)動(dòng)物模型，能夠?yàn)樗幬锏呐R床試驗(yàn)提供給藥依據(jù)和劑量指導(dǎo)?；谄渑c人類基因組的相似性[11]，目前仍是藥物安全性評(píng)價(jià)的首選模型。然而現(xiàn)在并沒有成熟的食蟹猴腫瘤模型，因此，需要使用另一種給藥方式來評(píng)估溶瘤病毒的安全性。所以本研究采用BALB/c小鼠腫瘤模型模擬外源基因表達(dá)。由于BALB/c小鼠具有成熟的腫瘤模型，因而對(duì)食蟹猴皮下基因表達(dá)的安全性評(píng)價(jià)可能有一定的指導(dǎo)及參考價(jià)值。