陸輝志，李 偉，董 輝，曹 松，楊璐瑜，廖友霞，付守芝

(武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院/武漢市第三醫(yī)院急診與重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430060)

在全球范圍內(nèi)，心臟停搏(cardiac arrest，CA)仍是導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。近年來(lái)，隨著心肺復(fù)蘇技術(shù)(cardiopulmonary-cerebral resuscitation，CPR)的進(jìn)步，CA患者恢復(fù)自主循環(huán)的比率有所提升，但幸存者通常發(fā)生嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[2-3]。復(fù)蘇后患者出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的病理生理機(jī)制極其復(fù)雜，其中，心搏停止后腦缺氧導(dǎo)致的水腫及炎癥反應(yīng)具有重要的致病作用。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是一個(gè)多效能激素，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用，在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移及神經(jīng)發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4]。本研究將探討IGF-1對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠腦水腫及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

IGF-1：上海肯強(qiáng)貿(mào)易有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒：武漢博士德生物技術(shù)有限公司；MPO檢測(cè)試劑盒：武漢博士德生物技術(shù)有限公司；p-p65抗體及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；多功能自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MolecularDevices公司；高速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；Westernblot儀器購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；水浴恒溫?fù)u床(SHY-2，江蘇)，紫外分光光度計(jì)(CE 2041，英國(guó))，呼吸機(jī)(HX-200)及BL-420E+生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(泰蒙公司，成都)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

36只清潔級(jí)雄性成年SD大鼠，體重250～300g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005]，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、心臟停搏/心肺復(fù)蘇組(CA/CPR組)和IGF-1處理組(IGF-1組)，每組各12只。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容已通過(guò)武漢市三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度、濕度相對(duì)恒定的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)[溫度(24±2)℃、濕度(55±5)%]，12h晝夜交替，自由進(jìn)食水，術(shù)前禁食水8h。

1.3 模型制備及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測(cè)心電圖。氣管切開(kāi)插管；分離右頸動(dòng)脈，接多導(dǎo)心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)；分離右側(cè)股靜脈，24號(hào)留置針穿刺置管，肝素封管備用，穩(wěn)定10min后開(kāi)始試驗(yàn)。IGF-1組經(jīng)股靜脈置管給予IGF-1，以40ng/g的劑量給藥[5]，Sham組及CA組給予等同劑量的生理鹽水。給藥30min后于呼氣末夾閉氣管導(dǎo)管，通過(guò)窒息誘導(dǎo)心臟驟停。心臟驟停標(biāo)準(zhǔn)為:心電圖示心電靜止、室顫、心電機(jī)械分離；心尖區(qū)心臟搏動(dòng)消失或MAP低于20mmHg[6]。心搏停止6min后開(kāi)始心肺復(fù)蘇，以食指按壓胸部，200次/min；同時(shí)恢復(fù)機(jī)械通氣，呼吸頻率為50次/min，潮氣量6mL/kg，吸氧濃度100%；經(jīng)股靜脈注射腎上腺素(0.01mg/kg)；如有必要，給予電除顫(5J)。如第一次除顫后不能恢復(fù)自主心跳，則在30s后重復(fù)一次。CPR成功標(biāo)準(zhǔn):心電圖出現(xiàn)正常的QRS波群，可觸及到明顯的心臟搏動(dòng)或MAP升至60mmHg以上。如心肺復(fù)蘇5min未成功，則停止復(fù)蘇，宣告死亡。復(fù)蘇成功后繼續(xù)給予生命支持治療。24h后取腦組織，-80℃冰箱保存。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 濕-干重比值法測(cè)定腦組織含水量

取適量腦組織，吸水紙吸干多余的水分，稱(chēng)重，記為濕重；將腦組織放在100℃的烤箱中48h，烤至恒重，再次稱(chēng)重，記為干重。腦含水量計(jì)算方法為：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.2 MPO活性檢測(cè)

取適量腦組織，加入50mmol含0.5%十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，HETAB)的PBS溶液(pH6.0)，超聲波裂解勻漿，41 000g離心10min。取上清0.3 mL，加入2.3mL反應(yīng)混合物，反應(yīng)混合物含50mmol PBS、聯(lián)甲氧基苯胺和20mmol H2O2溶液。在460nm處測(cè)量吸光度值，MPO活性以U/g蛋白表達(dá)[7]。

1.4.3 ELISA檢測(cè)腦組織中炎癥因子含量

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用ELISA試劑盒檢測(cè)腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，武漢，中國(guó))水平。取適量腦組織，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，超聲波破碎儀勻漿，4℃ 12 000g離心10min，取上清。測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將OD值轉(zhuǎn)換為濃度值。

1.4.4 Western blot分析

取腦組織100mg，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，以30μg蛋白上樣量計(jì)算上樣體積。加上樣緩沖液，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入p-p65及GAPDH一抗(均為兔抗，1∶1 000，CST公司)，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，ECL試劑發(fā)光顯色，拍照，ImageJ軟件分析測(cè)定條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織含水量的比較

與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組腦組織含水量顯著升高(P<0.05)；與CA組相比，IGF-1組腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

與Sham組相比，*P<0.05；與CA/CPR組相比，#P<0.05，(n=12)

2.2 各組大鼠腦組織MPO活性的比較

CA/CPR組及IGF-1組MPO活性顯著高于Sham組(P<0.05)，與CA/CPR組相比，IGF-1組MPO的活性顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

與Sham組相比，*P<0.05；與CA/CPR組相比，#P<0.05，(n=12)

2.3 各組大鼠腦組織炎癥因子含量的比較

與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組中炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量均顯著升高；而與CA/CPR組相比，IGF-1組中3種炎癥因子含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而腦組織中IL-10的表達(dá)量與此相反，Sham組大鼠腦組織中IL-10的含量相對(duì)較高，與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組IL-10的含量均顯著降低(P<0.05)，但與CA/CPR組相比，IGF-1組中IL-10含量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織炎癥因子比較

2.4 各組大鼠腦組織p-p65表達(dá)量的比較

與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組p-p65的表達(dá)量增加(P<0.01)，而IGF-1組的表達(dá)水平較CA/CPR組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

A.Westernblot典型條帶圖；B.p-p65相對(duì)表達(dá)量(與Sham組相比，*P<0.05；與CA/CPR組相比，#P<0.05)

3 討 論

CA/CPR術(shù)后腦保護(hù)一直是世界性難題，也是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，減輕CPR術(shù)后腦水腫及炎癥反應(yīng)對(duì)于改善幸存者預(yù)后具有重要意義。IGF-1是一種多效能激素，具有重要的生理學(xué)功能。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，IGF-1具有神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)修復(fù)作用[8]；Yang等[9]的研究表明，缺血性卒中可導(dǎo)致血循環(huán)中IGF-1含量減少，而經(jīng)靜脈給予IGF-1后，缺血腦組織及海馬、大腦皮質(zhì)中IGF-1水平明顯升高，同時(shí)觀察到大鼠的神經(jīng)功能、認(rèn)知功能及腦水腫得到明顯改善。本研究采用CA/CPR模型，通過(guò)測(cè)定濕/干比并進(jìn)行ELISA、Western blot等相關(guān)檢測(cè)，驗(yàn)證了IGF-1能減輕大鼠CPR后腦水腫及炎癥反應(yīng)。

腦損傷是CA和心肺復(fù)蘇CPR幸存者致病致死的重要原因，而CA/CPR術(shù)后腦水腫是幸存者腦損傷的重要表現(xiàn)，CA/CPR術(shù)后腦水腫通常提示預(yù)后不良。腦水腫可分為細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，腦缺血主要導(dǎo)致細(xì)胞毒性腦水腫，而血管源性腦水腫通常出現(xiàn)在再灌注恢復(fù)以后[10]。CA/CPR引起全身組織器官缺血再灌注損傷，也稱(chēng)心臟停搏后綜合征，既可導(dǎo)致細(xì)胞毒性腦水腫，又可引起血管源性腦水腫。彌漫性腦水腫可加重CA/CPR患者的腦損傷，且通常提示預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，CA/CPR后大鼠腦組織含水量顯著增加；而IGF-1預(yù)處理則顯著降低了大鼠腦組織含水量，從而驗(yàn)證IGF-1能改善CA/CPR后腦水腫，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

MPO是中性粒細(xì)胞分泌的活性酶，它是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及活化的重要標(biāo)志。心臟停搏后血液循環(huán)中斷，全身組織器官灌注不足，組織缺血必將導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)。復(fù)蘇成功后，隨著血供恢復(fù)，缺血期產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)由損傷部位釋放入血循環(huán)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，致使血管通透性增加，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。研究表明[11-12]，腦缺血將激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致MPO活性升高，本研究結(jié)果與此一致，CA/CPR組大鼠腦組織MPO活性較Sham組顯著增加，而IGF-1干預(yù)則顯著降低了MPO的活性。

缺血再灌注損傷是CA/CPR的重要機(jī)制之一，腦供血中斷導(dǎo)致腦組織氧供及能量供應(yīng)不足，激活炎癥通路，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇CA/CPR后腦損傷。在CA及自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation，ROSC)以后，白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和組織細(xì)胞通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路感知損傷，釋放大量細(xì)胞因子，進(jìn)一步放大局部和全身反應(yīng)[13]。本研究也證實(shí)，CPR組出現(xiàn)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為ROSC后腦組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)顯著升高，而抗炎細(xì)胞因子IL-10則明顯下降，IGF-1干預(yù)則在一定程度上逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)局。由此表明，IGF-1預(yù)處理能抑制CPR后腦組織炎癥反應(yīng)。

NF-κB是重要的炎癥信號(hào)通路，在生理情況下處于非活化狀態(tài)，一經(jīng)活化可調(diào)控多種炎癥因子的表達(dá)。心臟停搏后，全身組織器官灌注減少，引起組織缺氧，進(jìn)而激活NF-κB并使其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯。先前研究表明[12-13]，CA/CPR后NF-κB通路激活。本研究結(jié)果與此一致，CPR后腦組織中p-p65表達(dá)量增多，而IGF-1預(yù)處理則明顯抑制了NF-κB通路的激活。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，IGF-1預(yù)處理能減輕CA/CPR后腦水腫及腦炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB通路有關(guān)。