胡仿香，劉雨悅，李 霜

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800)

脂肽(lipopeptides)是由芽孢桿菌屬微生物產生的次級代謝產物，按其結構特征，大致可分為環(huán)狀脂肽(cyclic lipopeptides，CLPs)與線性脂肽兩類[1]。其中，關于線性脂肽的報道有螺旋形素(spiroidesin)及TAN 1511 系列[2]，環(huán)狀脂肽是主要的脂肽形式。在環(huán)狀脂肽分子中，有疏水的脂肪酸鏈和親水的肽鏈，其顯著特征在于由內酯鍵或酰胺鍵構成的肽環(huán)，主要包括表面活性素(surfactins)、伊枯草菌素(iturins)和芬介素(fengycins)這3類家族，其中，表面活性素家族具有很好的表面活性，在石油化工等領域具有廣泛的應用前景[3-4]，而伊枯草素和芬介素家族具有很好的抗菌活性，可用于食品、醫(yī)藥等領域[5]。

近年來，環(huán)狀脂肽的研究主要可分為3個方向：發(fā)酵優(yōu)化、菌株改良及結構改造。發(fā)酵優(yōu)化研究主要涉及pH、溫度、攪拌速度、供氧、培養(yǎng)基組分和生物反應器設計[6-7]。隨著合成生物學的發(fā)展，菌株的理性設計及改良也逐漸成為研究熱點[8-9]，主要包含關鍵基因的啟動子改造、基因敲除及表達強化等手段促進環(huán)狀脂肽的合成。環(huán)狀脂肽的結構改造主要包含肽環(huán)結構修飾和脂酰基結構修飾兩部分，分子結構改造及修飾對其物理活性和生理活性具有顯著影響[10]。

本文重點討論脂肪酸前體參與脂肽合成的機制及支鏈氨基酸與支鏈脂肪酸對環(huán)脂肽結構的影響，總結環(huán)狀脂肽的結構修飾策略，以期推動新型脂肽結構的開發(fā)與研究。

1 環(huán)狀脂肽的結構多樣性及性質

環(huán)狀脂肽根據(jù)成環(huán)方式的不同可以分為surfactins、iturins和fengycins三大家族(圖1)，其中，surfactins家族的肽環(huán)含有7個氨基酸，脂?；Y構為C13～C15的β-羥基脂肪酸，肽鏈末位氨基酸的羧基與脂肪酸鏈上的β-羥基通過內酯鍵連接成環(huán)[11]。由于肽環(huán)上1、2、4和7位氨基酸的變化，surfactins家族又被劃分為表面活性素(surfactin)、地衣芽孢桿菌素(linchenysin)和短小芽孢桿菌表面活性劑(pumilacidin)三大類。Iturins的肽環(huán)同樣含有7個氨基酸，脂?；Y構為C14～C17的β-氨基脂肪酸，脂?；系摩?氨基與肽鏈末位氨基酸的羧基以酰胺鍵成環(huán)。由于6、7位氨基酸的變化，Iturins家族又被細分為伊枯草菌素(iturin)、抗霉枯草菌素(mycosubtili)和桿菌霉素(bacillomycin)三類。Fengycins的多肽部分是由10個氨基酸構成的，其肽環(huán)通過第3位的 L-酪氨酸和末位的 L-異亮氨酸以內酯鍵結合而成，肽段的 N 端與長度為C14～C18的β-羥基脂肪酸鏈相連構成疏水尾部[12-13]。Fengycins中芬介素(fengycin)和大側柏素(plipatatin)的產生主要是由于1，2和4位置上氨基酸的變化而得[14-15]。

圖1 環(huán)狀脂肽三大家族的分子結構式Fig.1 Structures of the three lipopeptide families

由于脂?；拈L度和構型不同，每一種脂肽分子產生了許多異構體。脂肪酸鏈具有不同的支鏈形式，根據(jù)構型可以分為iso-、anteiso-和straight(n)-(圖2)，且由于芽孢桿菌脂肪酸從頭合成起始步驟對支鏈脂肪酸的偏愛性，芽孢桿菌產生的脂肽中，脂?；Y構絕大多數(shù)為支鏈脂肪酸形式存在[16]。目前已經(jīng)表征出來的含支鏈脂肪酸的surfactin、 bacillomycin和fengycin在各自的總量中都占據(jù)主導地位[10，17-18]。

圖2 脂肪酸的不同構型Fig.2 Various configurations of fatty acids

這些結構特征上的差異使得各種環(huán)脂肽的功能也具有顯著差異。Surfactins具有更強的表面活性，iturins具有很好的抗真菌活性，而fengycins則具有比iturins更好的抗真菌活性[19]。除此之外，Bonmatin等[20]發(fā)現(xiàn)，當surfactin的肽環(huán)組分上第4位由L-Val變成L-Ile的時候，其臨界膠束濃度(CMC)值降低一半，但界面穩(wěn)定性顯著提高。Dufour等[21]發(fā)現(xiàn)，當surfactin的內酯鍵結構被破壞時，線性surfactin的溶血性、抗菌性和起泡性等都明顯減低。在抗真菌活性和表面活性方面，脂肪酸構型為straight(n)-的surfactin強于iso-強于anteiso-，且鏈長越長，表面活性也越強[22]。

2 與結構多樣性相關的合成途徑

環(huán)狀脂肽生物表面活性劑的結構多樣性主要取決于肽段結構和脂?；Y構的合成。肽段結構的合成主要取決于非核糖體肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS) -非核糖體肽合成酶雜合體系 (PKS-NRPS)；而脂?；Y構的合成主要與支鏈脂肪酸前體的合成以及NRPS、PKS/NRPS的識別有關，其中還涉及支鏈氨基酸前體的合成。

2.1 非核糖體肽合成酶與結構的關聯(lián)性

Surfactins、fengycins和iturins的多肽部分都是由NRPS負責合成，NRPS是多功能模塊組裝的多酶復合體[23]。一個基本的NRPS延伸模塊至少包含3個基本結構域：腺苷酸化結構域(A)、肽基載體蛋白結構域(PCP)(也被稱為硫醇化結構域(T))和縮合結構域(C)。A域用于識別氨基酸底物并將其激活為氨?；?腺苷酸, 在輔因子4′-PP的作用下，PCP(T)域上的巰基與氨酰腺苷酸結合，形成氨酰載體復合體，并在該結構域的作用下被傳送到C域，與前一個模塊的肽鏈相連接。有的模塊還會有一個差向異構酶結構域(E)，其作用是將被激活的 L-氨基酸轉化為 D-氨基酸。NRPS的末端模塊通常具有硫酯酶域(TE)，該域參與環(huán)化和產物釋放[24]。Surfactin、fengycin和iturin的合成酶基因簇如圖3所示，其中，負責surfactin合成的基因簇包含3個編碼基因srfAA、srfAB和srfAC，srfAA和srfAB負責前6個氨基酸的整合，而srfAC負責最后1個氨基酸的整合。與surfactin合成基因簇類似，編碼fengycin合成酶的基因主要包含fenC、fenD、fenE、fenA和fenB這5個基因。不同于surfactin和fengycin，iturin是通過雜合體系 PKS-NRPS合成的[25]，后3個基因ituA、ituB和ituC負責編碼合成iturin肽環(huán)結構的NRPS，位于基因簇最上游的ituD負責編碼脂?；Y構前體合成有關的丙二酰輔酶A轉酰酶(MCT domain)，ituA的部分基因也參與編碼脂?；Y構合成相關的聚酮合成酶[26]。由此可見，脂肽的肽環(huán)結構主要取決于NRPS，其氨基酸多樣性也主要與該模塊A域對氨基酸底物的專一性有關。

圖3 Surfactin、fengycin、plipastatin和iturin的合成酶基因簇Fig.3 Operons of surfactin,fengycin,plipastatin and iturin synthases

2.2 脂肪酸鏈的合成相關途徑

環(huán)脂肽中的脂?；Y構與細胞中的脂肪酸前體密切相關。由于枯草芽孢桿菌中負責脂肪合成起始的3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ(FabH)對支鏈脂酰-CoA 前體具有高選擇性和高活性，使其在枯草芽孢桿菌中能大量合成支鏈脂肪酸[27]；Youssef等[10]研究發(fā)現(xiàn)，帶有支鏈脂肪酸的脂?；Y構在所有芽孢桿菌屬產的脂肽中占主導地位。因此，支鏈脂肪酸的合成對于環(huán)脂肽的合成及結構都具有十分重要的意義。支鏈脂肪酸的合成與支鏈氨基酸的代謝密切相關[28]，如圖4所示，異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸在支鏈氨基酸脫氫酶復合體的作用下會降解為相應的支鏈脂酰CoA：α-甲基丁酰CoA、異丁酰CoA和異戊酰CoA，這些支鏈脂酰CoA就是支鏈脂肪酸的合成前體，這些前體先與丙二酰-ACP在FabH的作用下縮合為相應的脂酰-ACP；緊接著，這些脂酰ACP前體進入脂肪酸的生物合成循環(huán)，生成相應的支鏈脂肪酸：anteiso-奇數(shù)脂肪酸、iso-偶數(shù)脂肪酸和iso-奇數(shù)脂肪酸[8，29-30]。由此可見，支鏈氨基酸是通過酶系降解為不同的支鏈脂酰CoA，從而參與到支鏈脂肪酸的合成中。Dhali等[22]通過敲除支鏈氨基酸降解途徑中相關基因，使得芽孢桿菌中的支鏈脂肪酸合成嚴重受阻，從而進一步影響了surfactin中支鏈脂肪酸的組分。

圖4 支鏈氨基酸的代謝與支鏈脂肪酸的合成Fig.4 Metabolism of branched-chain amino acids and synthesis with branched-chain fatty acids

脂肪酸參與surfactin的合成是通過以下步驟進行的：①游離脂肪酸在脂肪酸β羥基化細胞色素酶和長鏈脂肪酸CoA連接酶的作用下，生成羥基化脂肪酰CoA；②羥基化脂肪酰CoA被surfactin合成酶基因簇的第一個C域所識別，從而參與到surfactin的合成中，且C域對脂肪酸鏈長的識別具有專一性，特異性識別C13～C15的鏈長，這也是surfactin脂肪酸鏈長有局限性的原因[31-32]。脂肪酸參與iturin的合成主要是由iturin合成酶基因簇上的ituA基因負責的：①脂肪酸被長鏈脂肪?；鵄MP連接酶 (FAALs)活化為酰基-腺苷酸酯；②?；?腺苷酸酯與輔酶CoA反應形成?；?CoA硫酯中間體，由?；B接酶(AL)負載到?；d體蛋白1(ACP1)上，丙二酰輔酶A通過MCT負載到?；d體蛋白2(ACP2)上，兩者通過酮合酶(KS)結構域縮合得到一個被AMT結構域還原胺化的α-酮硫酯；③α-氨基脂肪硫酯通過縮合(C)和肽基載體蛋白(PCP)傳遞到ituA的NRPS結構域上[33]。關于脂肪酸是如何參與到fengycin合成中的研究還沒有詳細報道，但是由于fengycin的結構及合成酶簇與surfactin十分相似，因此推測脂肪酸參與fengycin的合成過程也大致相同。

3 環(huán)脂肽分子的結構修飾策略

隨著分子生物學技術的發(fā)展，目前許多研究開始致力于修飾環(huán)脂肽的結構，以期產生新型脂肽。環(huán)脂肽的結構修飾包括兩個方面：一方面是針對肽環(huán)的改造，另一方面是對脂?；鶚嬓偷母脑?。通過基因工程技術，有目的地改變與環(huán)脂肽結構相關的合成途徑，形成可預測的新結構產物，這些人為產生的新結構化合物表現(xiàn)出新的功能或活性。

3.1 具有不同肽環(huán)結構的新型環(huán)脂肽

在脂肽分子中，肽結構部分的序列通常與NRPS模塊和結構域的線性排列一致。理論上，這種結構能夠通過基因片段的重組產生肽結構的衍生物陣列。因此，通過合理設計NRPS模塊就可以獲得豐富的脂肽多樣性。目前，肽環(huán)結構的修飾主要是對NRPS基因簇中負責識別氨基酸專一性的結構域或模塊進行點突變，結構域或模塊被指定不同底物的替代物和/或模塊的插入/缺失引起的相關模塊進行定點突變、刪除、替換、插入和模塊“洗牌”[34]。

表1 改造B. subtilis BP2-L1菌株獲得肽環(huán)修飾的新型plipastatin

目前，關于脂肽sufactin和plipastatin的肽環(huán)結構研究比較多，且關于surfactin肽環(huán)結構的修飾策略已有詳細闡述，主要包含模塊的突變、替換和刪除這3種手段。文獻[8]對surfactin肽環(huán)結構改造進行了較為全面的總結，新型surfactin通常有更低的溶血活性和更高的抗菌活性，但是新結構產物在細胞中的合成量也嚴重受損。

目前，針對fengycins家族的肽環(huán)結構修飾研究也有報道，其中對B.subtilisBP2-L1菌株中plipastatin的結構研究最為豐富，如表1所示。Gao等[35]對脂肽plipastatin的NRPS合成酶相關模塊和結構域進行刪除后，產生了一系列plipastatin衍生物，結果發(fā)現(xiàn)，整個模塊的刪除往往會導致整個酶復合物的失活，從而導致plipastatin不能合成，而不同結構域的刪除卻會產生不同的結果：例如，當整個模塊6和模塊7被刪除時以及第六模塊的單個結構域T缺失時，菌株喪失了合成plipastatin的能力；當模塊7中的單個結構域(A/T結構域)缺失時，造成了NRPS合成裝配線的截斷，導致線性六肽的產生；當?shù)诹K的單個結構域A缺失時，通過模塊跳躍機制(module-skipping mechanism)產生多條裝配線，導致了3種新型脂肽(線性五肽、六肽和八肽)的產生。

除了對常規(guī)結構域的修飾，還有一些研究主要是針對linker，即信息介導域(COM)結構域的修飾。COM結構域是在NRPS合成酶中結構域與結構域之間存在的一段具有特殊序列的肽段，它確保了各個結構域、模塊以及結構域與模塊之間的信息交流，從而保證NRPS合成的連續(xù)性，且這種作用的關鍵在于COM的供體和受體[36]。不同COM具有不同的選擇性，這種選擇性是特定肽產物的合成基礎。Chiocchini等[37]也通過COM域交換實驗證實了COM域在模塊之間的控制作用，且進一步發(fā)現(xiàn)，當打破COM結構域的選擇性時，可以合成不同的脂肽產物。Liu等[38]通過改造芬介素家族plipastatin中的COM結構域，進一步證實了COM結構域對于合成新型脂肽的重要意義，通過點突變、供體刪除、置換以及刪除和置換這4種策略成功獲得了5種新型脂肽：環(huán)狀五肽，線性六肽、九肽、七肽和環(huán)狀八肽(表1)，且新型脂肽具有很好的抗真菌活性。除此之外，Gao等[39]還通過將plipastatin合成酶基因簇C端TE域移至其他模塊PCP域，進一步證實了COM域在脂肽合成中的重要性，結果發(fā)現(xiàn)，只有采用第10模塊的PCP-TE的COM作為TE域與其他PCP域連接時，重組菌才能成功地產生可預測的截短的環(huán)狀或線性脂肽，反之則不能；但是，重組菌產的新型脂肽產量相當?shù)?，普遍低?0 mg/L。

由此可見，在改造sufactin和plipastatin的肽環(huán)結構時，產生的新型化合物雖然有更好的抗菌活性，但是往往會造成不產和產量極低的情況，因此，通過改造NRPS的組裝線來實現(xiàn)脂肽結構和功能的多樣性充滿了挑戰(zhàn)性。NRPS作為一個復雜而又精致的分子裝配機器，各模塊、結構域及鏈接區(qū)之間功能聯(lián)系的復雜性導致了實際操作結果的不理想。不過，值得借鑒的案例是，Beer等[40]在改造負責藍色顏料靛藍合成的NRPS時發(fā)現(xiàn)，用高度同源性的不改變活性中心位點的人工合成T結構域替換天然T結構域可以顯著提高靛藍產量。這表明，實現(xiàn)NRPS酶系的真正組合生物合成必須充分地認識每個結構域并進行合理的設計來確保NRPS模塊、域或亞域的變化不會對合成過程產生有害影響。

3.2 脂肽的脂?；Y構的改造

脂肽的脂酰基結構與脂肽的物理化學性質和生物活性緊密相關，目前關于脂?；Y構改造的研究相對較少。脂?；慕Y構多樣性主要體現(xiàn)在脂肪酸的鏈長以及脂肪酸的構型。一方面，脂肪酸的鏈長明顯會影響iturin家族的抗菌活性和surfactin家族的表面活性：脂肪酸鏈越長，iturin家族bacillomycin和mycosubtilin的抗真菌活性越強，surfactin的表界面活性顯著增強[10，41]；脂肪酸的鏈長對脂肽的發(fā)泡能力也有影響，脂肪鏈為C14的surfactin的發(fā)泡能力強于C13和C15的[22]。另一方面，脂肪酸的構型對脂肽的抗真菌活性和表面活性也有影響，構型性能強弱順序(從大到小)為straight(n)-、iso-、anteiso-。構型的占比不同對脂肽的活性也有很大的影響，當lichenysin中支鏈構型增多時，表面活性明顯降低；反之，則表面活性增高[42]。Liu等[43]的研究結果也表明：surfactin的脂酰基結構差異對其在微生物采油(MEOR)中的應用效果有顯著影響；在同等工作濃度下，脂肪鏈為C15的surfactin組分含量越高，其對油砂清洗效率和原油驅替效率越高。因此，通過對脂肽的脂酰結構改造，有可能獲得具有特殊理化性質及生物活性的新結構化合物，促進脂肽在表面活性劑和抗菌等領域的應用。

盡管脂肪酸前體對脂?；Y構的合成具有重要影響，但是向培養(yǎng)基中添加油脂或游離脂肪酸并不能促進脂肽的合成，反而起抑制作用[44]；而添加氨基酸卻可以使脂肽的脂?；Y構和產量發(fā)生明顯變化[45]。Liu等[46]發(fā)現(xiàn)，向B.subtilisT89-42菌株的培養(yǎng)基中添加Arg、Gln時，可以增加surfactin的偶數(shù)β-羥基脂肪酸組分(C14、C16)，而添加Cys、His、Met、Ser或Thr可以增加奇數(shù)β-羥基脂肪酸組分(C13、C15)；除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)添加支鏈氨基酸會引起更顯著的脂酰基結構變化：添加L-亮氨酸(L-Leu)會明顯增加產物中iso-奇數(shù)脂?；M分的占比；添加L-異亮氨酸(L-Ile)會增加產物中anteiso-奇數(shù)脂肪酰基組分的占比；而添加L-Val則會增加iso-偶數(shù)脂酰基組分的占比。筆者所在課題組的研究結果[47-48]證明了支鏈氨基酸添加對surfactin合成及組分占比具有顯著影響，并進一步揭示了不同的支鏈脂肪酸(異丁酸、異戊酸與2-甲基丁酸)對最終surfactin組分占比的影響。

近年來，通過代謝工程手段改造支鏈氨基酸合成途徑來促進surfactin合成或改變surfactin脂?；M分成為研究熱點。Coutte等[29]通過敲除支鏈氨基酸合成途徑的負調控因子codY使得支鏈氨基酸L-Leu的合成能力增強，最終不僅讓surfactin的產量達到最高，還使得surfactin的結構組分發(fā)生了變化：對照菌株中C13和C14的組分分別是39.7%和21.2%，而敲除了codY后的這一比例分別為26.5%和40.6%。后來，他們在此基礎上敲除了負責支鏈氨基酸最后一步降解的基因lpdV后，帶有直鏈C14的surfactin產量提高了2.5倍[22]。

顯而易見，通過外源添加氨基酸或內源改造氨基酸代謝途徑還是不能突破surfactin脂?；Y構的局限性，不能定向合成特定的構型和鏈長的脂?；Y構。因此，探究脂肪酸前體參與脂肽合成的機制并打破脂?；孜镒R別的局限性具有重要意義。筆者推測，通過解析surfactin合成起始模塊C域的底物脂肪酸選擇機制及對底物識別的關鍵活性位點，有可能構建出能催化特殊結構脂酰基底物的起始模塊，從而獲得新型surfactin。而對iturin脂?；Y構改造的關鍵節(jié)點在于AL-ACP1結構域，ACP1可以承載多種脂肪酸底物，改造脂酰CoA連接酶FACLs和起始模塊ACP域的底物選擇性，有望獲得基于PKS/NRPS合成的新型天然產物。關于fengycins家族的脂?；铣蓹C制目前沒有詳細報道，仍需進一步研究，可從以下兩個方面入手：第一，找到不同的脂肪酸CoA連接酶，通過基因敲除的手段驗證脂肪酸CoA連接酶對于fengycin合成的影響；第二，解析起始模塊中C域對不同脂肪酸的偏愛性。

4 前景展望

芽孢桿菌屬產生的環(huán)脂肽次級代謝產物，由于具有多種功能活性，在環(huán)境、農業(yè)和MEOR等領域都有很好的應用前景。然而，由于生產成本高和易發(fā)泡等問題，目前關于脂肽的研究還普遍處于實驗室水平，不能達到工業(yè)化生產規(guī)模。為了解決這兩個問題，一方面，可以參考之前關于surfactin合成途徑改造策略：利用基因工程模塊化改造前體供應模塊，中間轉錄調控模塊及外排和提高自身耐受性模塊來獲得高產的優(yōu)良菌株。另一方面可以通過生產工藝，如固定化培養(yǎng)、無泡反應器設計及調節(jié)供氧水平解決脂肽發(fā)酵過程中的泡沫溢出問題。

除了以上兩點外，未來關于脂肽的研究重點還會集中在脂肽的結構改造上。由于微生物合成的環(huán)脂肽家族產物均為各種結構組分的混合物，且不同結構組分的性質有所差別，因此，通過定向改造獲得特定組分或新型結構的脂肽產物，有助于適應特定目標和拓展脂肽的應用領域。隨著NRPS的結構解析以及組合生物合成技術在NRPS結構改造中的應用，定向改造脂肽的肽環(huán)結構部分會獲得強大的技術支撐。目前，關于脂肽結構改造的瓶頸主要包含肽環(huán)結構改造后的目標產物產量極低及脂?；Y構仍然缺乏可靠的調控手段兩方面。當前，解決肽環(huán)修飾帶來的低產問題及找到更好的定向修飾脂酰基結構的方法，是未來脂肽結構改造需要突破的核心問題。