閆玉卿，董鵬程，張一敏，毛衍偉，梁榮蓉，朱立賢 ，羅 欣,2

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；2. 江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210095)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是導(dǎo)致食源性疾病的重要致病菌之一，在肉類食品中的污染率較高[1]。據(jù)歐盟食品安全局(EFSA)統(tǒng)計(jì)，沙門氏菌近年來一直是歐盟的第二大常見的人畜共患病致病菌，并且大多數(shù)來源于動(dòng)物性食品[2-3]。據(jù)估計(jì)，沙門氏菌每年在全球會造成9 380萬人感染和15.5萬人死亡[4]。2009—2015年，美國由沙門氏菌引起的疾病暴發(fā)了896次、23 662例，在由單一確診病因的暴發(fā)疾病中占到30%，位居第二[5]。2014年，歐盟報(bào)告的確診人類沙門氏菌病的病例就高達(dá)88 175例，導(dǎo)致了9 830人住院治療和65人死亡[6]。2008—2015年，我國食品中毒事件中，因微生物導(dǎo)致的食物中毒事件占62.02%，而在所有的致病菌中，沙門氏菌占比為23%，居于首位[7]。綜上所述，沙門氏菌是一種容易引起高爆發(fā)率疾病的食源性致病菌，威脅著人類的健康。

生物被膜(biofilm)是一種復(fù)雜的多糖蛋白復(fù)合物，它由在生物或非生物表面附著的細(xì)菌以及細(xì)菌分泌的胞外聚合物(EPS)組成[8]。胞外聚合物包括多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及細(xì)胞外DNA等，它們使細(xì)菌相互黏附并附著在物體表面[9]。沙門氏菌能夠在不同器物的接觸表面形成生物被膜，如玻璃、不銹鋼、聚乙烯等；鼠傷寒沙門氏菌還可以在肉湯的氣-液界面形成生物被膜[10]。生物被膜一旦形成，對各種殺菌劑和環(huán)境變化的敏感性大大降低，與浮游菌相比，生物被膜對抗菌素的抗性更強(qiáng)，這使得清除食品加工設(shè)施上的生物被膜成為一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[11]，傳統(tǒng)的殺菌措施不能夠有效地將其去除，從而造成持續(xù)污染[12]。有研究統(tǒng)計(jì)，生物被膜對農(nóng)產(chǎn)品加工、乳制品、水產(chǎn)、畜禽加工和即食食品等工業(yè)都會產(chǎn)生一些不利影響[13]。尤其在肉類工業(yè)中，致病菌和腐敗菌形成的生物被膜會成為加工產(chǎn)品的持續(xù)污染源，導(dǎo)致嚴(yán)重的衛(wèi)生問題和經(jīng)濟(jì)損失[14]。

1 沙門氏菌生物被膜的主要結(jié)構(gòu)組成與調(diào)節(jié)因子

1.1 生物被膜的主要結(jié)構(gòu)成分

1.1.1 蛋白類成分

卷曲菌毛(curli fimbriae)是一種由csgBAC-csgDEFG操縱子編碼的富含蛋白質(zhì)的絲狀物質(zhì)，具有很強(qiáng)的黏附性，在細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和定殖等過程中非常重要。卷曲菌毛在生物被膜的形成過程中可以促進(jìn)細(xì)菌在表面的初始黏附以及細(xì)菌間的相互作用。有學(xué)者通過構(gòu)建卷曲菌毛相關(guān)基因csgA與csgD的缺失菌株，研究它們在沙門氏菌生物被膜形成過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因缺失的沙門氏菌完全不能形成生物被膜，從而印證了卷曲菌毛在生物被膜形成過程中起著重要的作用[15]。此外，卷曲菌毛還會影響沙門氏菌的表型，研究發(fā)現(xiàn)具有完整卷曲菌毛的沙門氏菌在含有剛果紅的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型的RDAR(紅色、干燥和粗糙)形態(tài)，然而未能產(chǎn)生完整的卷曲菌毛會導(dǎo)致剛果紅培養(yǎng)基瓊脂平板上出現(xiàn)PDAR(粉紅色、干燥和粗糙)形態(tài)[16]。除卷曲菌毛外，沙門氏菌表面另一種常見的菌毛——Ⅰ型菌毛(type Ⅰ fimbriae)在細(xì)菌黏附和生物被膜形成過程中同樣起到重要作用。Ⅰ型菌毛由fim基因簇(fimA～H)編碼，其主要結(jié)構(gòu)亞基FimA由基因fimA編碼，由fimH基因編碼的結(jié)構(gòu)亞基FimH可與宿主細(xì)胞上含甘露糖的糖蛋白受體結(jié)合而介導(dǎo)細(xì)菌黏附[17]。

與菌毛不同，鞭毛是一種長螺旋狀可旋轉(zhuǎn)的多蛋白組裝體，作為細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官位于細(xì)菌細(xì)胞表面，使細(xì)菌能在液體培養(yǎng)基中游動(dòng)，并群集于固體表面，是細(xì)菌單一泳動(dòng)和群集泳動(dòng)中不可或缺的組件。鞭毛組件的主要調(diào)節(jié)蛋白包括FlhD、FlhC、FliA、FliZ、FlgM、FliD和FliT等，而控制鞭毛基因表達(dá)的啟動(dòng)子分為三類：1類啟動(dòng)子(PflhDC啟動(dòng)子)編碼2種蛋白質(zhì)FlhD和FlhC；2類啟動(dòng)子控制構(gòu)成鉤基體(HBB)、絲帽蛋白(FliD)和調(diào)節(jié)蛋白(FliA、FlgM、FliZ和FliT)等結(jié)構(gòu)元件的表達(dá)；3類啟動(dòng)子由FliA激活，正向調(diào)控自身表達(dá)以及編碼FlgM、FliZ、FliD和FliT的基因表達(dá)[18]。鞭毛素為鞭毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位，沙門氏菌中鞭毛素由單一的fliC基因編碼。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)鞭毛素編碼基因fliC缺失后，腸炎沙門氏菌成膜能力下降一半左右[19]。

生物膜相關(guān)蛋白(BAPs)是細(xì)菌在黏附過程中的重要蛋白，也存在于成熟的生物被膜中。BapA是腸炎沙門氏菌形成生物被膜所必需的第二大蛋白，由位于bapA基因下游的Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)(BapBCD)分泌。Latasa等[20]研究發(fā)現(xiàn)，基因bapA的缺失會導(dǎo)致生物被膜形成能力的喪失，而bapA的過表達(dá)增加了生物被膜的形成能力；他們還發(fā)現(xiàn)卷曲菌毛的過量產(chǎn)生可以彌補(bǔ)bapA突變株的生物被膜缺陷。

沙門氏菌常通過一般分泌途徑(GSP)來分泌蛋白，如菌毛。沙門氏菌利用GSP同源物分泌可溶性蛋白(如纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等)，它們可以分解大分子物質(zhì)供細(xì)菌利用。此外，沙門氏菌還可利用GSP分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，GspD是一種完整的外膜蛋白，它是由12種單體組成的多聚體復(fù)合物，可以轉(zhuǎn)運(yùn)大分子。GSP蛋白在分泌功能上具有高度特異性，不同細(xì)菌來源的蛋白不能相互替代[21-22]。

1.1.2 胞外多糖

纖維素(cellulose)是一種由bcsABZC-bcsEFG基因編碼的β-1，4-D葡萄糖聚合物，它是胞外多糖的重要組成部分，可以支持長距離的細(xì)胞間相互作用，從而產(chǎn)生黏性質(zhì)地，在生物被膜形成過程中起重要作用。Solano等[23]進(jìn)行的bcsC和bcsE基因的非極性突變以及互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，這2個(gè)操縱子均在腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌中負(fù)責(zé)纖維素的生物合成。真核細(xì)胞的細(xì)菌黏附和侵襲試驗(yàn)以及缺乏纖維素的突變體的體內(nèi)毒力研究表明，纖維素的產(chǎn)生與腸炎沙門氏菌的毒力無關(guān)。但是，缺乏纖維素的突變體對氯處理更敏感，這表明纖維素的產(chǎn)生和生物被膜的形成可能是腸炎沙門氏菌在表面環(huán)境中存活的重要因素。

脂多糖(lipopolysaccharide)是介導(dǎo)沙門氏菌生物被膜形成的關(guān)鍵組分，rfaG基因編碼的葡糖基轉(zhuǎn)移酶和rfaJ基因編碼的1,2-葡糖基轉(zhuǎn)移酶都參與脂多糖生物合成[24]。Kim等[25]研究發(fā)現(xiàn)：rfbA基因也會影響脂多糖，當(dāng)生物被膜在肉湯、禽肉以及各種材料上形成時(shí)，rfbA突變會使脂多糖發(fā)生異常。此外，rpoN基因在細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，它負(fù)責(zé)胞外多糖的產(chǎn)生，被認(rèn)為與生物被膜的形成有關(guān)，該基因受到sigma因子調(diào)控[26]。莢膜異多糖酸是一種莢膜細(xì)胞外多糖，它有助于沙門氏菌在上皮細(xì)胞上形成三維結(jié)構(gòu)[27]。然而這種胞外多糖對于非生物表面沙門氏菌生物被膜的形成不是必需的。

生物被膜中的各個(gè)組分之間既相互作用又相互影響，共同維持生物被膜的完整性和穩(wěn)定性。Gibson等[28]研究發(fā)現(xiàn)，正常的卷曲菌毛產(chǎn)量會使纖維素的產(chǎn)量降低，而卷曲菌毛與纖維素之間的產(chǎn)量平衡在一定程度上又受到脂多糖的影響。胞外DNA(eDNA)是胞外聚合物中的核酸成分，有促進(jìn)生物被膜形成、參與遺傳信息傳遞以及抗菌等作用[29-31]。eDNA的釋放由糖基酶和外膜蛋白磷脂酶A的活性觸發(fā)[32]，而eDNA又與胞外多糖、胞外蛋白以及一些代謝產(chǎn)物結(jié)合，可保持EPS結(jié)構(gòu)完整性。

1.2 沙門氏菌生物被膜中的主要調(diào)節(jié)因子

1.2.1 CsgD

CsgD是一種由csgD基因編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，作為沙門氏菌生物被膜形成的主要控制和整合單元，可調(diào)節(jié)特定沙門氏菌生物被膜相關(guān)基質(zhì)化合物的表達(dá)。Grantcharova等[33]使用csgD基因突變菌株在玻璃上進(jìn)行生物被膜實(shí)驗(yàn)，表明CsgD是生物被膜成熟所必需的，且在微菌落形成中是必不可少的[33]。CsgD可以正向調(diào)控卷曲菌毛和纖維素的合成，如圖1所示。

圖1 CsgD對卷曲菌毛和纖維素的調(diào)控Fig.1 Regulation of CsgD on curli fimbriae and cellulose

CsgD通過調(diào)節(jié)csgBAC編碼的結(jié)構(gòu)性卷曲菌毛亞基的轉(zhuǎn)錄來控制卷曲菌毛的合成，CsgA作為編碼卷曲菌毛的主要子單元也受到CsgD的調(diào)控。CsgD上調(diào)了glyA基因的表達(dá)，glyA編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)負(fù)責(zé)甘氨酸的生物合成。CsgA的N端是一個(gè)富含甘氨酸的氨基酸區(qū)，因此SHMT活性的上調(diào)促進(jìn)了CsgA的合成，從而促進(jìn)生物被膜的形成。此外,csgC與csgEFG的基因產(chǎn)物對卷曲菌毛的產(chǎn)生具有輔助作用。纖維素的生物合成也受到CsgD的正向調(diào)控。CsgD刺激AdrA(膜結(jié)合的具有雙鳥苷酸環(huán)化酶活性的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白，該蛋白參與環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)的合成)的轉(zhuǎn)錄，AdrA通過與纖維素合成操縱子bcsABZC-bcsEFG的基因產(chǎn)物相互作用促進(jìn)纖維素的合成。此外，AdrA產(chǎn)生的環(huán)狀核苷酸是纖維素合成的活化劑[34]。

CsgD還能夠調(diào)節(jié)O-Ag莢膜，這種莢膜由操縱子yihU-yshA和yihVW合成并轉(zhuǎn)運(yùn)，是EPS的另一種重要組分。CsgD通過抑制調(diào)節(jié)因子YihW來激活yihU-yshA，并與其他細(xì)胞外基質(zhì)化合物協(xié)同作用，對yih操縱子進(jìn)行差異調(diào)節(jié)[28]。綜上所述，CsgD可被視為生物被膜控制點(diǎn)，調(diào)節(jié)所有主要沙門氏菌生物被膜成分的表達(dá)，并控制浮游菌和生物被膜之間的過渡。

1.2.2 c-di-GMP

c-di-GMP是一種重要的細(xì)菌第二信使，它能對多種細(xì)胞外信號作出反應(yīng)，還可以控制動(dòng)物和植物病原菌的毒力，參與某些細(xì)菌的細(xì)胞周期控制[35]。c-di-GMP的產(chǎn)生和降解分別由鳥苷酸環(huán)化酶(GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白)和磷酸二酯酶(EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白)完成。AdrA是第一個(gè)被識別的對沙門氏菌生物被膜形成起重要作用的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白，在纖維素生物合成中具有調(diào)節(jié)作用。當(dāng)adrA基因過表達(dá)時(shí)，環(huán)境中的c-di-GMP水平會升高。Simm等[36]使用CR/CF分析和細(xì)胞c-di-GMP定量分析，研究顯示AdrA通過c-di-GMP的轉(zhuǎn)錄后，會對負(fù)責(zé)纖維素生物合成的bcs基因發(fā)揮作用。然而當(dāng)編碼EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的yhjH基因過表達(dá)時(shí)，環(huán)境中的c-di-GMP水平降低；且研究發(fā)現(xiàn)STM3611和STM1827(EAL結(jié)構(gòu)域蛋白)參與細(xì)胞c-di-GMP水平的下調(diào)，從而導(dǎo)致纖維素產(chǎn)量降低，生物被膜形成減少。

通常，高c-di-GMP水平會刺激各種黏附素和生物被膜相關(guān)的胞外多糖的產(chǎn)生，并降低鞭毛的表達(dá)和活性[37]。Kader等[38]研究發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP濃度升高，除了激活纖維素的生物合成外，還通過增強(qiáng)CsgD和CsgA的表達(dá)來增強(qiáng)卷曲菌毛的產(chǎn)生。同樣地，當(dāng)環(huán)境中CsgD和CsgA的表達(dá)量較高時(shí)，c-di-GMP的濃度也會提高，再次激活CsgD的表達(dá)，最終形成一個(gè)正反饋循環(huán)。當(dāng)c-di-GMP與鞭毛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FleQ結(jié)合時(shí)，會使該蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，從而無法調(diào)節(jié)下游的鞭毛基因。此外，Ha等[39]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)c-di-GMP水平升高時(shí)，YcgR蛋白會與鞭毛的轉(zhuǎn)子蛋白FliG以及定子蛋白MotA相互作用，使得運(yùn)動(dòng)能力降低。

1.2.3 群體感應(yīng)信號分子

群體感應(yīng)(QS)是細(xì)菌通過分泌化學(xué)信號并對化學(xué)信號作出反應(yīng)而相互交流的過程，群體感應(yīng)在毒性、抗生素耐藥性、生物被膜形成和運(yùn)動(dòng)性方面起到重要作用。群體感應(yīng)系統(tǒng)由自誘導(dǎo)物、群體感應(yīng)信號分子和調(diào)控蛋白組成。

在沙門氏菌中，QS機(jī)制常通過自誘導(dǎo)因子(AI)介導(dǎo)，即AI-1、AI-2。革蘭氏陰性菌使用的是AI-1通信系統(tǒng)，其群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)由LuxI型酶(AHL合成酶)在一定環(huán)境下合成。AHL可以通過細(xì)菌膜自由擴(kuò)散，通過特定的通道到達(dá)細(xì)胞外，并在環(huán)境中積累。當(dāng)環(huán)境中的AHL濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，AHL自動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)LuxR結(jié)合，引起細(xì)菌細(xì)胞特異性功能基因的表達(dá)[40]。Chorianopoulos等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在牙槽菌培養(yǎng)的無細(xì)胞上清液中存在AHL，對沙門氏菌生物被膜的發(fā)育有負(fù)面影響，但是沙門氏菌的這個(gè)系統(tǒng)是不完整的，因?yàn)樗缓芯幋aAI-1合成酶的同源LuxI的基因，因此細(xì)菌無法產(chǎn)生自己的AHL信號。然而，沙門氏菌存在一種稱為SdiA的蛋白質(zhì)，這是一種與LuxR同源的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以響應(yīng)由其他微生物產(chǎn)生的、能夠自由通過細(xì)胞膜擴(kuò)散的AHL[42]。

AI-2是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中都存在的群體感應(yīng)信號，可以調(diào)控生物被膜的形成、黏附能力等。隨著細(xì)菌數(shù)量的增加，AI-2在細(xì)胞外膜中逐漸積累，最后通過在Lsr操縱子中合成的Lsr轉(zhuǎn)運(yùn)體將AI-2導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)膜[8]。AI-2的合成、分泌與信號傳遞受到luxS基因調(diào)控的操縱子調(diào)控。AI-2的前體為4,5-二羥基-2,3-戊二酮(DPD)，它是S-腺苷蛋氨酸(SAM)代謝的副產(chǎn)物，由luxS基因編碼的LuxS酶是SAM分解代謝過程中的關(guān)鍵酶[43]。周文淵等[44]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛可以抑制沙門氏菌的AI-2的活力，從而減少生物被膜的生成。

2 沙門氏菌生物被膜形成的影響因素

2.1 菌株特性

沙門氏菌生物被膜的形成能力與其菌株自身的特性有關(guān)，例如血清型的不同、基因的表達(dá)狀況不同以及胞外聚合結(jié)構(gòu)的表達(dá)等。Wang等[45]在研究從牛肉中分離的腸道沙門氏菌菌株的生物被膜形成能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的菌株之間生物被膜的形成能力具有高度的菌株特異性，并且與卷曲菌毛和纖維素的產(chǎn)生密切相關(guān)。Yin等[46]在研究沙門氏菌的生物被膜時(shí)發(fā)現(xiàn)，來源于中國肉牛屠宰廠的8個(gè)血清型、70多株沙門氏菌中，不同血清型的沙門氏菌形成生物被膜的能力不同，其中山夫登堡沙門氏菌(Salmonellasenftenberg)和金斯敦沙門氏菌(Salmonellakingston)形成生物被膜的能力較強(qiáng)，而同種血清型中不同的菌株生物被膜的形成能力也存在差異。此外，不同菌株之間泳動(dòng)能力、自聚性能等的差異也會影響生物被膜的形成。

2.2 接觸面特征

當(dāng)沙門氏菌在材料表面黏附時(shí)，接觸面的特征是影響生物被膜形成的重要因素，其中包括材料的不同、接觸表面粗糙度以及表面疏水性等。王虎虎等[47]研究沙門氏菌生物被膜在不同食品接觸面的轉(zhuǎn)移率時(shí)發(fā)現(xiàn)，生物被膜在不同材料上的轉(zhuǎn)移率差異顯著，其中，生物被膜在不銹鋼、玻璃以及聚乙烯表面的轉(zhuǎn)移率較大。生物被膜在不同材料上的轉(zhuǎn)移率與材料的表面疏水性、粗糙度以及電荷量等有關(guān)。Dhowlaghar等[48]使用掃描電子顯微鏡觀察食物接觸面上沙門氏菌生物被膜的形成狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與不銹鋼、聚乙烯和聚氨酯表面相比，生物被膜在buna-N橡膠表面的含量最少，而此種橡膠的表面疏水性強(qiáng)、表面能量低、粗糙度強(qiáng)。Nguyen等[49]研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌可以附著在不銹鋼和丙烯酸材料的表面，但在不銹鋼表面的附著性更強(qiáng)。這是因?yàn)椴讳P鋼是親水的，與疏水表面相比，細(xì)菌更容易附著在這些表面。Benhamed等[50]研究發(fā)現(xiàn)，疏水材料比親水材料更不易附著細(xì)菌。

2.3 環(huán)境因素

環(huán)境因素是影響生物被膜形成的又一個(gè)重要因素，其中包括環(huán)境的溫度、pH、生存環(huán)境中的營養(yǎng)成分以及離子含量等。溫度是影響生物被膜形成的重要因素，溫度對生物被膜形成的影響依賴于生物被膜形成階段：在指數(shù)階段，隨著溫度的升高，生物被膜的數(shù)量增加；而一旦達(dá)到穩(wěn)態(tài)，則出現(xiàn)相反的趨勢；此時(shí)隨著溫度的升高，生物被膜的形成速率增加，而生物被膜的形成總量隨著溫度的升高而減小[51]。

Iliadis等[52]在研究低營養(yǎng)條件下溫度、pH和NaCl濃度對腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，NaCl含量的增加限制了生物被膜的生長，在低NaCl濃度下，pH從4.5增加到7.4對生物被膜的形成起到了有利作用；同時(shí)也驗(yàn)證了腸炎沙門氏菌生物被膜形成的最適溫度為34.5 ℃。O′Leary等[53]研究酸性環(huán)境對傷寒沙門氏菌DT104分離株生物被膜形成和基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，與培養(yǎng)基pH為7的環(huán)境相比，分離株1481在培養(yǎng)基pH為5時(shí)生物被膜形成的相關(guān)基因csgD和mlrA以及毒力相關(guān)基因hilA和invA表達(dá)上調(diào)。此外，營養(yǎng)物質(zhì)是生物被膜形成過程中的關(guān)鍵物質(zhì)，Paz-méndez等[54]研究發(fā)現(xiàn)，與牛奶汁、番茄汁和雞肉汁相比，在營養(yǎng)成分更高的大豆胰蛋白酶培養(yǎng)基中的沙門氏菌成膜率更高。

2.4 其他微生物的影響

在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，食品器具等的表面微生物種類繁雜，生物被膜常常以混合生物被膜的形式存在，沙門氏菌生物被膜的形成受到環(huán)境中其他微生物的影響。Gómez等[55]發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌、彎曲乳桿菌等在48 h內(nèi)會對沙門氏菌的生物被膜完全抑制。這些乳酸菌主要通過與潛在的病原體混合或產(chǎn)生抗微生物物質(zhì)和抑制細(xì)菌黏附的生物表面活性劑來抑制生物被膜[56]。Petrova等[57]證實(shí)了從益生菌株鼠李糖乳桿菌GG中分離到的凝集素樣分子對包括沙門氏菌在內(nèi)的多種病原體形成的生物被膜具有明顯的抑制作用。

競爭與合作是混合生物被膜菌落中主要的細(xì)菌相互作用形式。能分泌生物表面活性劑、多糖或酶(如核酸酶和蛋白酶)的細(xì)菌，可減弱細(xì)菌與表面和細(xì)菌與細(xì)菌之間的相互作用，并減少細(xì)菌定殖和生物被膜的形成，或增加細(xì)胞的分散。同時(shí)，生物被膜中的細(xì)菌相互作用也可以促進(jìn)細(xì)菌定殖和生物被膜的形成。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌對沙門氏菌具有生物拮抗作用，其通過分泌酸降低pH從而降低病原菌的競爭，或通過對營養(yǎng)物質(zhì)和定殖位點(diǎn)的競爭來影響沙門氏菌的生長[58]。Pang等[59]將腸炎沙門氏菌與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合生物被膜中沙門氏菌的數(shù)量明顯低于單菌種生物被膜，這是由于銅綠假單胞菌的拮抗作用。此外，混合生物被膜對氯的耐受能力增加，熒光顯微鏡圖像顯示，混合生物被膜中存在較多的多糖復(fù)合物，這可能是腸炎沙門氏菌耐氯能力增強(qiáng)的原因之一。Chen等[60]研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7共培養(yǎng)后，2種菌相互拮抗且對加入混合生物被膜中的乙酰丙酸更敏感。

多種微生物間的交互作用使得生物被膜的形成比單一菌種更復(fù)雜，在不同的階段，生物被膜間的進(jìn)化是動(dòng)態(tài)的。目前其他微生物與沙門氏菌共存時(shí)對沙門氏菌生物被膜的影響尚不明確，且沙門氏菌與其他微生物共存對消毒劑的敏感性或耐受性也會受到影響，但相關(guān)機(jī)制尚不清楚，該方面的研究是今后關(guān)注的方向之一。

3 沙門氏菌生物被膜的控制

3.1 消毒劑

消毒劑在食品加工廠中常用來抑制和清除食品器械表面的生物被膜，其主要通過殺死細(xì)菌、減少活菌數(shù)來控制生物被膜的形成。屠宰加工過程中常見的消毒劑有含氯消毒劑、H2O2、過氧乙酸等[11]。氯、乙醇和乳酸等消毒劑對于沙門氏菌生物被膜都有抑制作用，一般來說，這些消毒劑的抗菌活性取決于其本身濃度。在高濃度時(shí)，氯會腐蝕設(shè)備，乙醇易燃；而低濃度下，細(xì)菌可能會存活并產(chǎn)生誘導(dǎo)耐酸響應(yīng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的耐酸性；當(dāng)乙醇類消毒劑與氯、乳酸聯(lián)合使用時(shí)，在較低濃度下就能達(dá)到較高的抗菌活性[61]。

將消毒劑與其他影響生物被膜的物質(zhì)聯(lián)合使用往往會得到更好的抗生物被膜效果，Vestby等[62]用合成溴化呋喃酮對常規(guī)消毒劑(如次氯酸鹽和苯扎氯銨)在消毒前進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯著提高了消毒劑的致死效果，因?yàn)殇寤秽獪p少了沙門氏菌生物被膜的形成，生物被膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而更易接受后續(xù)的抗菌處理。Lamas等[63]研究發(fā)現(xiàn)，將防腐劑添加到培養(yǎng)基中會對一些與生物被膜形成相關(guān)的基因產(chǎn)生影響：在含亞硫酸鈉(SS)、亞硝酸鈉(SN)、乙酸鈉與檸檬酸混合物(SA)的培養(yǎng)基中，基因csgD顯著下調(diào)。而csgD編碼的生物被膜主要調(diào)節(jié)因子CsgD負(fù)責(zé)編碼卷曲菌毛以及通過adrA和c-di-GMP調(diào)控纖維素的合成；在SS、SA培養(yǎng)基中，群體感應(yīng)相關(guān)基因sdiA顯著下調(diào)；鼠傷寒沙門氏菌中的毒力基因invA的轉(zhuǎn)錄也在3種培養(yǎng)基中下調(diào)。Kim等[64]使用熱處理、紫外線、H2O2和乳酸等幾種在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的干預(yù)措施來干擾傷寒沙門氏菌在非生物表面的初始附著時(shí)發(fā)現(xiàn)，在食品加工過程中，受傷的細(xì)胞有很多機(jī)會存活并附著在非生物表面，熱、紫外線和H2O2只能損傷細(xì)胞但對其附著性能影響不顯著，而乳酸處理能有效降低附著在非生物表面的細(xì)菌數(shù)量，從而有效地延緩其初始附著和生物被膜的形成。因此可以考慮，將物理方法與消毒劑兩者有機(jī)結(jié)合起來，會獲得更好的抑制效果。

1990年7月,在美國巴爾的摩召開的第一屆國際納米科學(xué)與納米技術(shù)大會上“納米技術(shù)”(Nanoscaletechnology)這一新概念被提了出來。而所謂納米藥物就是指通過一定的微細(xì)加工方式對某些具有藥用價(jià)值或其他的物質(zhì)直接進(jìn)行操作，形成新的具有納米尺度的物質(zhì)或載體[1]。納米藥物主要包括納米晶、納米乳、納米球、納米囊、脂質(zhì)體和膠束等[2]。像脂質(zhì)體、膠束等納米藥物相關(guān)技術(shù)已經(jīng)成熟，而且已有上市產(chǎn)品，如力樸素等。

3.2 群體感應(yīng)抑制劑

AI-2是革蘭氏細(xì)菌中常見的一種自誘導(dǎo)物，沙門氏菌可以通過AI-2調(diào)節(jié)毒力因子的產(chǎn)生和生物被膜的形成。LsrA是一種ATP結(jié)合蛋白，在轉(zhuǎn)運(yùn)AI-2方面起著重要作用。展青霉素(patulin)具有AI-2的結(jié)構(gòu)類似物，是一種群體感應(yīng)抑制劑。

Vijayababu等[65]研究發(fā)現(xiàn)，30 μg/mL的patulin對傷寒沙門氏菌生物被膜的形成有明顯的抑制作用，patulin與LsrA蛋白的關(guān)鍵殘基通過氫鍵相互作用，阻斷了AI-2的轉(zhuǎn)運(yùn)。賈坤等[66]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的AHL信號分子對鼠傷寒沙門氏菌生物被膜具有抑制作用，且隨著AHL添加量升高，抑制作用增強(qiáng)。c-di-GMP是存在于沙門氏菌中的一種信號分子，它能夠調(diào)控生物被膜的形成。Li等[67]研究發(fā)現(xiàn)，鄰氨基苯甲酸鹽對腸炎沙門氏菌生物被膜具有抑制作用，它通過降低細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平并增強(qiáng)泳動(dòng)能力來抑制生物被膜的形成。

3.3 生物控制措施

噬菌體是一種能侵染細(xì)菌并影響生物被膜形成的病毒，它能夠直接攻擊生物被膜內(nèi)的細(xì)菌，而不攻擊胞外聚合物，是一種高效的生物學(xué)抑制方法。此外，噬菌體侵染EPS邊緣的一些細(xì)菌，導(dǎo)致噬菌體越來越多。生物被膜上細(xì)菌的減少導(dǎo)致EPS物質(zhì)的消減，最終將生物被膜完全去除[68]。Ferreira等[69]研究發(fā)現(xiàn)，使用溶菌噬菌體對不銹鋼上的腸炎沙門氏菌生物被膜進(jìn)行降解時(shí)，在第8天使用107 PFU/mL的噬菌體處理生物被膜35 min清除效果最好。

酶是對特定化學(xué)分子具有催化活性的蛋白質(zhì)，它可以有效且靶向去除生物被膜。單一的酶不能有效地破壞生物被膜結(jié)構(gòu)，但是當(dāng)其與表面活性劑結(jié)合時(shí)可以提高酶的去除效率[70]。生物表面活性劑是一種可以降低液體和固體表面張力的化合物，它們穿透固體基質(zhì)與生物被膜之間的界面并吸附在界面上，通過降低界面張力使得細(xì)菌表面和固體表面之間的吸引力作用減少，使得生物被膜更易去除[71]。

此外，利用沙門氏菌與其他細(xì)菌的拮抗作用也能實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌生物被膜的控制。乳酸菌等益生菌可以通過影響毒力基因的表達(dá)、生物被膜的形成和群體感應(yīng)來抑制病原體。由革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是核糖體合成的抗菌肽，對其他細(xì)菌具有抗菌活性[72]。Vandeplas等[73]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素和產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌對沙門氏菌具有一定的控制能力。

3.4 其他控制措施

一些從植物中提取的活性成分、新型化學(xué)材料等也能有效抑制生物被膜。精油是從植物中提取的芳香族油性液體，以其抗菌活性聞名。Oh等[74]在實(shí)驗(yàn)中將牛至、百里香酚、香芹酚精油加入培養(yǎng)沙門氏菌生物被膜的96孔板中，最后發(fā)現(xiàn)，3種精油對沙門氏菌生物被膜的形成均有抑制作用，且香芹酚精油和百里香酚精油的抑制效果更好。

銀納米粒子有較好的抑菌效果，但是銀納米粒子本身是不穩(wěn)定的。Ag@AgCl是把銀納米粒子和其他材料雜化在一起的一種更加穩(wěn)定的新型材料，將其用來處理鼠傷寒沙門氏菌生物被膜，獲得了很好的抑制效果，Ag@AgCl是通過抑菌和降低細(xì)菌黏附性能來抑制生物被膜的形成[75]。

血根堿是一種天然的植物源性抗菌物質(zhì)，王靜慧等[76]研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌生物被膜所產(chǎn)的胞外多糖在血根堿處理后有明顯的減少，從而證明了血根堿可通過抑制沙門氏菌產(chǎn)生胞外多糖來抑制生物被膜的形成。唐玉霞等[77]研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡葉的34%乙醇洗脫成分對沙門氏菌生物被膜具有抑制作用，其中的綠原酸和槲皮素等活性成分對沙門氏菌的細(xì)胞疏水性和泳動(dòng)能力產(chǎn)生影響，從而抑制了生物被膜的形成。

4 結(jié)論

在食品工業(yè)中，食品及其加工器械上的生物被膜增加了病原微生物傳播的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致食品被污染，進(jìn)而威脅消費(fèi)者的健康。隨著對致病微生物的深入研究，對沙門氏菌生物被膜的形成過程及其機(jī)制、影響因素、控制清除措施的研究也更全面。

沙門氏菌生物被膜的形成過程非常復(fù)雜，生物被膜的形成不僅取決于菌體特性和遺傳基礎(chǔ)，還取決于環(huán)境因素，包括溫度、pH、表面特性、營養(yǎng)成分和背景菌群等。

目前對生物被膜的抑制主要使用抗生素和消毒劑，然而生物被膜對其具有極高的耐藥性，因此尋找新的和有效的策略來控制它變得至關(guān)重要。隨著對生物被膜形成的分子機(jī)制、群體感應(yīng)信號通路的研究越來越深入，從分子層面通過抑制細(xì)菌毒力、限制耐藥性、抑制生物被膜調(diào)節(jié)因子等相對應(yīng)的干預(yù)措施來抑制沙門氏菌生物被膜將成為今后的研究熱點(diǎn)。