林榮芳 高麗偉 徐夢豪 趙祥忠

(齊魯工業(yè)大學(xué)〔山東省科學(xué)院〕食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353)

裂壺藻(Schizochytrium)，屬網(wǎng)黏菌綱破囊壺菌目破囊壺菌科，單細(xì)胞藻類海洋微生物[1]。裂壺藻油是裂壺藻的主要合成產(chǎn)物，含豐富的二十二碳六烯酸(DHA)。DHA能夠抑制炎癥，降低心血管疾病、高血壓等的患病風(fēng)險(xiǎn)[2-4]，促進(jìn)大腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育[5]。裂壺藻油富含多不飽和脂肪酸(PUFAs)，對(duì)貯藏條件敏感，極易發(fā)生氧化酸敗，而降低功效[6]。為了提高其氧化穩(wěn)定性，需在藻油中添加2,6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚(BHT)、2-叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等合成抗氧化劑，但合成抗氧化劑對(duì)人體內(nèi)臟器官有一定的毒副作用，長期食用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害性[7]。近年來，有關(guān)紫蘇、迷迭香、辣椒等香辛料中的天然抗氧化成分的研究較多且成果顯著[8]。

紫蘇(Perillafrutescens)別名赤蘇、香蘇、黑蘇等，為唇形科紫蘇屬一年生草本植物[9]，含有豐富的迷迭香酸、阿魏酸等多酚以及黃酮類化合物，具有抗氧化、抗衰老、抑菌、消炎等功能活性[10-13]。王亞平[14]研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇提取物對(duì)花生油和豬油的氧化穩(wěn)定起到非常好的效果，可有效抑制油脂的氧化酸敗。胡曉丹等[15]研究表明，0.09%的紫蘇醇提物對(duì)油脂具有較高的抗氧化活性。朱元龍[16]研究顯示，紫蘇葉提取物對(duì)花生油的抗氧化效果優(yōu)于大豆油，且紫蘇葉提取物的抗氧化作用強(qiáng)于維生素E和BHT。文章擬通過裂壺藻油強(qiáng)制氧化試驗(yàn)，以過氧化值、丙二醛值、茴香胺值、共軛二烯值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較紫蘇提取物在裂壺藻油中的抗氧化效果，為紫蘇提取物用作藻油的天然抗氧化劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇提取物：多酚、黃酮含量分別為40，27 mg/g，匯林生物制品有限公司；

裂壺藻油(未添加任何抗氧化劑)：青島瑯玡臺(tái)集團(tuán)股份有限公司；

TBHQ：純度≥99.0%，上海藍(lán)平實(shí)業(yè)有限公司；

茶多酚：純度≥99.0%，鄭州康源化工產(chǎn)品有限公司；

硫酸：分析純，煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；

異辛烷：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

對(duì)氨基苯甲醚：分析純，山東旭晨化工科技有限公司；

甲醇：色譜級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

正己烷：色譜級(jí)，常州市傲華化工有限公司；

無水硫酸鈉：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

MDA試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV-9000型，上海元析儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，常州國宇儀器制造有限公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：TG16-WS型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

旋渦混勻器：XW-80A型，上海馳唐電子有限公司；

超聲波清洗器：KQ5200E型，昆山市超聲儀器有限公司；

萬分之一天平：FA1004型，上海上平儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：BPG-9056A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Aglient 7890B GC-5977B MSD型，美國安捷倫公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-2000A型，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的影響 紫蘇提取物以多酚含量進(jìn)行換算，最大添加量為0.1%，將紫蘇提取物添加量設(shè)置為0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，以未添加紫蘇提取物的裂壺藻油為空白組，于60 ℃烘箱中進(jìn)行周期為15 d的強(qiáng)制氧化，每24 h攪拌均勻，并且任意交換位置。每3 d進(jìn)行取樣，檢測藻油的過氧化值、丙二醛值、共軛二烯值、茴香胺值，強(qiáng)制氧化結(jié)束后對(duì)藻油進(jìn)行脂肪酸檢測。

1.3.2 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的影響 根據(jù)GB 2760—2014，茶多酚、TBHQ最大添加量分別為0.04%，0.02%，且為抗氧化效果最佳劑量[17-19]，與紫蘇提取物最佳劑量進(jìn)行比較。以未添加抗氧化劑的裂壺藻油為空白組。其中，由于茶多酚不溶于油脂，參照歐陽夢云等[20]的方法并修改：準(zhǔn)確稱取一定量的茶多酚溶于6 mL 乙醇，加入60 g裂壺藻油，混勻，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，制備高濃度的含茶多酚裂壺藻油。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測

(1)過氧化值：參照GB 5009.227—2016。

(2)丙二醛值：參照MDA測定試劑盒說明書。

(3)共軛二烯值：參照丁儉等[21]的方法。

(4)茴香胺值：參照GB/T 24304—2009。

1.3.4 脂肪酸組成分析

(1)樣品甲酯化處理：參照劉靜[22]的方法并修改。將0.30 g藻油置于具塞試管中，加入5 mL正己烷進(jìn)行溶解，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的硫酸—甲醇溶液，50 ℃恒溫水浴2 h，冷卻，加入4 mL正己烷，充分混勻，靜止10 min，取上清液，加入少量無水硫酸鈉，過0.22 μm濾膜。

(2)氣相色譜—質(zhì)譜分析：色譜柱為TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，進(jìn)樣量1 μL；載氣為高純氦氣，流量1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：60 ℃ 保持1.5 min，以30 ℃/min升溫至120 ℃，以1.5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持1.5 min。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃。利用儀器配置的NIST 14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)藻油樣品進(jìn)行定性分析，按照峰面積歸一法計(jì)算藻油樣品中各組分的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2017軟件繪圖，結(jié)果表示為平均值±SD。P<0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的影響

2.1.1 過氧化值 由圖1可知，強(qiáng)制氧化期間，各劑量組裂壺藻油中的過氧化值均因氧化時(shí)間的延長而增加，空白組的過氧化值變化最大。各劑量組的紫蘇提取物均對(duì)裂壺藻油過氧化值的增加起到抑制作用，與低劑量的紫蘇提取物相比，高劑量組的紫蘇提取物在各時(shí)間點(diǎn)的抑制過氧化效果更佳，呈一定的劑量效應(yīng)。與空白組相比，強(qiáng)制氧化第15天，添加0.10%紫蘇提取物的裂壺藻油組的過氧化值顯著降低49.97%(P<0.01)。由于紫蘇提取物中酚類物質(zhì)含量較高，且含有多種黃酮類化合物，如黃酮類、二氫黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類物質(zhì)[23]，能夠有效清除自由基，抑制油脂過氧化反應(yīng)，延緩裂壺藻油的初級(jí)氧化，減少初級(jí)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。

圖1 紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油過氧化值的影響Figure 1 The effect of different doses of perilla extract on the peroxide value of Schizochytrium oil

2.1.2 丙二醛值 裂壺藻油的初級(jí)氧化產(chǎn)物(ROOH)不穩(wěn)定，極易分解形成丙二醛等次級(jí)氧化產(chǎn)物，損害油脂的品質(zhì)，通過丙二醛含量反映油脂氧化程度[24]。由圖2可知，各組裂壺藻油中丙二醛值隨氧化時(shí)間的延長不斷增加，強(qiáng)制氧化0～6 d，各劑量組間丙二醛值的差異不明顯。強(qiáng)制氧化試驗(yàn)結(jié)束后，與空白組相比，各劑量組裂壺藻油中丙二醛含量均顯著降低(P<0.01)。0.10%，0.08%紫蘇提取物劑量組相比其他劑量組對(duì)丙二醛的抑制作用更加明顯，0.01%劑量組同比0.08%劑量組丙二醛值下降14.47%。綜上，紫蘇提取物可顯著抑制裂壺藻油的氧化，減少裂壺藻油初級(jí)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，試驗(yàn)所考察的紫蘇提取物劑量范圍均能有效地抑制裂壺藻油初級(jí)氧化產(chǎn)物分解生成丙二醛。

2.1.3 茴香胺值 油脂的氧化伴隨著大量初級(jí)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，氫過氧化物在氧化過程中會(huì)分解生成醛、酮、酸等次級(jí)氧化產(chǎn)物，這些產(chǎn)物通常會(huì)導(dǎo)致油脂產(chǎn)生令人不愉快的氣味[25]。由圖3可知，隨著氧化時(shí)間的延長，各組裂壺藻油中p-茴香胺值均增加；裂壺藻油中次級(jí)氧化產(chǎn)物開始增多，強(qiáng)制氧化第6天，空白組相比于其他劑量組p-茴香胺值開始顯著性增加(P<0.05)。與空白組相比，各劑量組由于紫蘇提取物的添加抑制了裂壺藻油的氧化，油脂中次級(jí)氧化產(chǎn)物減少，p-茴香胺值增加趨勢明顯降低。強(qiáng)制氧化第15天，0.10%紫蘇提取物劑量組的p-茴香胺值為51.88，相比空白組降低了33.02%，是各劑量組中p-茴香胺值下降趨勢最顯著的一組。

圖2 紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油丙二醛值的影響Figure 2 The effect of different doses of perilla extract on the malondialdehyde value of Schizochytrium oil

2.1.4 共軛二烯值 裂壺藻油因氧化會(huì)產(chǎn)生大量的氫過氧化合物，其中不飽和脂肪酸的雙鍵進(jìn)行重組，形成共軛二烯。由圖4可知，各組裂壺藻油的共軛二烯值均隨氧化時(shí)間的延長而增加，強(qiáng)制氧化6 d后，空白組的共軛二烯值增長趨勢明顯高于其他組。隨著紫蘇提取物添加劑量的增加，裂壺藻油中共軛二烯值的增加趨勢明顯減緩。強(qiáng)制氧化第15天，0.10%紫蘇提取物劑量組的共軛二烯值為27.79，相比空白組降低了47.23%；同比其他劑量組，裂壺藻油中添加0.10%的紫蘇提取物對(duì)抑制共軛二烯生成的效果更佳。

圖3 紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油茴香胺值的影響Figure 3 The effect of different doses of perilla extract on the anisidine value of Schizochytrium oil

圖4 紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油共軛二烯值的影響Figure 4 The effect of different doses of perilla powder on the conjugated diene value of Schizochytrium oil

2.2 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的影響

2.2.1 過氧化值 由圖5可知，添加0.10%紫蘇提取物、0.04%茶多酚、0.02% TBHQ的裂壺藻油的過氧化值均顯著低于空白組(P<0.05)。強(qiáng)制氧化6 d后，空白組的過氧化值增加趨勢明顯高于其他組。強(qiáng)制氧化0～9 d，紫蘇提取物添加組與TBHQ添加組的過氧化值無顯著差異；強(qiáng)制氧化9 d后，TBHQ添加組的效果優(yōu)于紫蘇提取物添加組。60 ℃下強(qiáng)制氧化15 d后，茶多酚添加組的過氧化值為19.44 meq/kg，紫蘇提取物添加組的裂壺藻油過氧化值相對(duì)茶多酚添加組的降低了21.35%；紫蘇提取物中含有豐富的黃酮類、酚類等天然抗氧化劑，相比單一茶多酚添加組對(duì)裂壺藻油的氧化抑制效果更明顯；TBHQ添加組的裂壺藻油過氧化值為13.52 meq/kg，相比紫蘇提取物添加組的降低了11.58%，說明紫蘇提取物的抗氧化效果略低于TBHQ。綜上，3種抗氧化劑提高裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的效果為0.02% TBHQ>0.10%紫蘇提取物>0.04%茶多酚。

2.2.2 丙二醛值 由圖6可知，強(qiáng)制氧化第3天，空白組裂壺藻油的丙二醛值開始明顯高于其他組。其中，茶多酚添加組丙二醛值于強(qiáng)制氧化第6天開始明顯高于紫蘇提取物添加組和TBHQ添加組。強(qiáng)制氧化第15天，與空白組相比，紫蘇提取物添加組、茶多酚添加組和TBHQ添加組丙二醛值分別降低了47.79%，33.77%，51.82%，紫蘇提取物和TBHQ抑制丙二醛升高的效果顯著高于茶多酚(P<0.05)。

2.2.3 茴香胺值 由圖7可知，強(qiáng)制氧化第6天，空白組的茴香胺值增加趨勢顯著高于抗氧化劑添加組(P<0.05)，強(qiáng)制氧化試驗(yàn)中，紫蘇提取物和TBHQ降低茴香胺值的效果優(yōu)于茶多酚；與空白組相比，紫蘇提取物添加組、茶多酚添加組和TBHQ添加組的茴香胺值分別降低了33.02%，24.96%，41.23%。

圖5 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油過氧化值的影響Figure 5 The effect of different antioxidants on the peroxide value of Schizochytrium oil

圖6 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油丙二醛值的影響Figure 6 The effect of different antioxidants on the malondialdehyde value of Schizochytrium oil

圖7 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油茴香胺值的影響Figure 7 The effect of different antioxidants on the anisidine value of Schizochytrium oil

2.2.4 共軛二烯值 由圖8可知，強(qiáng)制氧化期間，各組共軛二烯值均上升。其中，強(qiáng)制氧化0～9 d，0.10%紫蘇提取物組與0.02% TBHQ組的共軛二烯值無顯著性差異(P>0.05)。強(qiáng)制氧化第15天，紫蘇提取物添加組相比茶多酚添加組共軛二烯值降低了12.45%，TBHQ添加組相比紫蘇提取物添加組降低了14.47%，裂壺藻油中添加0.02% TBHQ對(duì)提高裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的效果最佳，紫蘇提取物對(duì)延緩油脂氧化的效果略低于TBHQ。

圖8 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油共軛二烯值的影響Figure 8 The effect of different antioxidants on the conjugated diene value of Schizochytrium oil

2.3 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油脂肪酸成分的影響

由圖9、圖10和表1可知，新鮮的裂壺藻油中不飽和脂肪酸相對(duì)含量為62.58%，其中以DHA為主，相對(duì)含量占47.66%。飽和脂肪酸以棕櫚酸為主，相對(duì)含量占32.13%。經(jīng)15 d的強(qiáng)制氧化試驗(yàn)，未添加抗氧化劑的空白組裂壺藻油的DHA、DPA等不飽和脂肪酸相對(duì)含量顯著下降(P<0.05)，棕櫚酸相對(duì)含量顯著增加(P<0.05)。紫蘇提取物添加組的DHA含量為41.50%，不飽和脂肪酸含量相比空白組提高了16.91%，說明紫蘇提取物可以通過延緩不飽和脂肪酸的氧化分解起到抗氧化效果，這與紫蘇提取物中酚類和黃酮類物質(zhì)清除自由基的活性有關(guān)。與其他抗氧化劑組相比，0.02% TBHQ組的不飽和脂肪酸含量最高，達(dá)59.66%，與過氧化值、丙二醛值、茴香胺值以及共軛二烯值的檢測結(jié)果一致。紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油的氧化抑制效果略低于TBHQ，不飽和脂肪酸含量僅減少了5.30%；紫蘇提取物相比茶多酚不飽和脂肪酸含量顯著增加了12.93%，抗氧化效果明顯高于茶多酚。綜上，各抗氧化劑對(duì)裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的作用效果為0.02% TBHQ>0.01%紫蘇提取物>0.04%茶多酚。

圖9 空白組裂壺藻油氣相色譜圖Figure 9 Gas chromatogram of Schizochytrium sp.oil in the blank group

圖10 0.10%紫蘇提取物添加組裂壺藻油氣相色譜圖Figure 10 Gas chromatogram of Schizochytrium sp.oil with 0.10% perilla extract

表1 抗氧化劑對(duì)裂壺藻油脂肪酸成分的影響Table 1 The effect of antioxidants on the fatty acid composition of Schizochytrium oil

3 結(jié)論

通過強(qiáng)制氧化法探究了不同劑量紫蘇提取物、0.04%茶多酚、0.02% TBHQ對(duì)裂壺藻油氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，紫蘇提取物能有效延緩裂壺藻油的氧化，隨著添加劑量的增加，裂壺藻油的氧化抑制效果也顯著提高。與茶多酚和TBHQ的抗氧化能力相比，0.10%紫蘇提取物對(duì)裂壺藻油的保護(hù)作用略低于0.02% TBHQ，但明顯高于0.04%茶多酚。紫蘇提取物作為一種天然產(chǎn)物，含有豐富的具有抗氧化活性的酚類、黃酮類化合物，這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中帶有能夠有效清除自由基和活性氧的酚羥基，同時(shí)，紫蘇提取物中各種抗氧化成分協(xié)同作用，有效阻隔油脂的鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)，比單一天然抗氧化劑能更有效地防止裂壺藻油的氧化，相比合成抗氧化劑TBHQ，紫蘇提取物的使用也更加安全、可靠。后續(xù)可深入探究紫蘇提取物對(duì)不同種類的油脂以及高油脂產(chǎn)品的氧化抑制作用，此外，探究紫蘇提取物完整的抗氧化機(jī)制將是后續(xù)工作重點(diǎn)。