黃水林 何 明

(深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測科技有限公司，廣東 深圳 518040)

B族維生素是人體內(nèi)一類重要的水溶性維生素，在人體代謝的甲基化、三羧酸循環(huán)等過程中，起著非常重要的作用，如果攝入不夠或者過量均會導(dǎo)致機體內(nèi)的代謝難以進行，從而產(chǎn)生疾病[1-3]。有研究[4]表明，高蛋氨酸、低葉酸和維生素B6、B12的飲食可能與netrin-1的表觀遺傳沉默導(dǎo)致的記憶喪失有關(guān)。而B族維生素在嬰兒的正常發(fā)育中至關(guān)重要[5-6]，如果攝入不足，可能會對機體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[7]。

GB 10765—2010和GB 10767—2010對嬰幼兒奶粉中允許添加的8種B族維生素給出了明確的限量。目前關(guān)于嬰幼兒奶粉及配方食品中B組維生素的分析方法主要集中在光譜分析法[8-9]、色譜分析法[10]、色譜質(zhì)譜分析法[11-13]和微生物法[14-16]。光譜分析法無分離步驟，每次只能測定一種目標物且受雜質(zhì)影響較大。色譜分析法可同時檢測多種目標物，但目標物數(shù)量太多，分離難度較大。微生物法步驟便捷，檢測快速，但檢測成本較高。質(zhì)譜法則具有目標物選擇性高，檢出限低和多種化合物準確定性定量的優(yōu)點，科研工作者也進行了相關(guān)研究，如陳美君等[12]建立了同時測定11種水溶性維生素的串聯(lián)質(zhì)譜法，但未使用內(nèi)標物對結(jié)果進行校正；嚴華等[13]所建立的方法，雖然使用了內(nèi)標進行校正，但測定10種水溶性維生素，需要使用兩種離子化模式，并要切換流動相組成，分析時間較長。研究擬使用直接超聲提取，等電點沉淀蛋白的前處理方法，建立一次進樣同時測定嬰幼兒配方奶粉中的10種水溶性維生素B的方法，為嬰幼兒食品中多種維生素的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

質(zhì)譜儀：API4000Q TRAP型，美國AB SCIEX公司；

液相色譜系統(tǒng)：LC-30AD型，日本島津公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Advantage A10型，法國Merck Millipore公司；

高速冷凍離心機：1-14K型，德國Sigma公司；

渦旋混勻器：IKA MS3型，德國IKA公司。

1.2 試劑

標準品：泛酸(純度≥95.8%)、煙酸(純度≥98.5%)、煙酰胺(純度≥98.0%)、葉酸(純度≥91.3%)、吡哆醛(純度≥98.0%)、吡哆醇(純度≥98.5%)、吡哆胺(純度≥98.2%)、硫胺素(純度≥98.0%)、核黃素(純度≥98.5%)、生物素(純度≥99%)，德國Dr公司；

內(nèi)標物：泛酸-D4(純度≥98.0%)、煙酸-D4(純度≥98.0%)、煙酰胺-D4(純度≥98.0%)、葉酸-D4(純度≥97.0%)、吡哆醛-D3(純度≥98.5%)、吡哆醇-D3(純度≥94.5%)、吡哆胺-D3(純度≥98.0%)、硫胺素-13C3(純度≥97.0%)、核黃素-13C4-15N2(純度≥95.0%)、生物素-D4(純度≥95.0%)，加拿大Research Chemical公司；

甲醇、乙酸銨：色譜純，美國Fisher公司；

鹽酸、氫氧化鈉、氨水：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

實驗用水：Milli-Q超純水：Milli-Q Advantage A10型超純水系統(tǒng)。

1.3 色譜條件優(yōu)化

在相同的色譜條件下，對比Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)對多種水溶性維生素的分離效果，有機流動相為甲醇，無機流動相為10 mmol/L乙酸銨，設(shè)定有機相為A相，無機相為B相，進樣體積10 μL；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；梯度洗脫程序：0～2 min，2% A；2～5 min，2%～35% A；5～7 min，35%～95% A；7～9 min，95% A；9～10 min，95%～2% A；10～15 min，2% A。

1.4 標準溶液配制

1.4.1 標準儲備液 分別稱取適量的維生素標準品及其同位素內(nèi)標，稱取適量的標準品至容量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸定容，配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L(折算標準品純度)。其中葉酸使用0.5%氨水配制。

1.4.2 標準中間液 10種維生素分別取0.5 mL于10 mL容量瓶，用水定容，混成50 mg/L標準中間液。

1.4.3 內(nèi)標中間液 取0.25 mL于10 mL容量瓶，用水定容，混成25 mg/L標準中間液。

1.4.4 標準工作曲線 分別準確移取2.0，10，20，50，100，200，500 μL的標準中間液于50 mL容量瓶中，加入100 μL的內(nèi)標溶液，用水稀釋中間液至各級質(zhì)量濃度為2.0，10，20，50，100，200，500 μg/L，得到標準系列曲線，其中內(nèi)標濃度均為50 μg/L。

1.5 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在ESI離子源下，采用全掃描模式和MRM掃描模式，氣簾氣207 kPa；毛細管電壓5 000 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣(GAS1)345 kPa；加熱輔助氣(GAS2)345 kPa；碰撞氣(CAD)中等；使用流動相混合的流動注射的方式將標準溶液直接注入質(zhì)譜，通過全掃描確定[M+H]+準分子離子峰(m/z)，MRM掃描確定最優(yōu)電壓。于三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜中進行測定。對最佳超聲時間和基質(zhì)效應(yīng)進行探討，并通過不同水平進行加標回收試驗，測定日內(nèi)相對標準偏差。

1.6 樣品前處理優(yōu)化

稱取2.5 g配方奶粉于50 mL塑料離心管，加入50 μL質(zhì)量濃度為25 mg/L混合內(nèi)標溶液，加入25 mL 40～50 ℃溫水，使配方奶粉充分溶解，超聲(5，10，15，20，25，30 min)，待樣品冷卻至室溫后，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1.8，靜置2 min，再用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.6。加蓋后以10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，根據(jù)各個化合物含量差異再用水稀釋一定的倍數(shù)，使含量在線性范圍內(nèi)，供UPLC-MS/MS測定。計算出水溶性維生素的回收率，確定最優(yōu)超聲時間。

1.7 基質(zhì)效應(yīng)探究

取空白原料基粉，按照優(yōu)化后的前處理方法進行處理，得到基質(zhì)液，用基質(zhì)液配置標準系列曲線，同時配置相同濃度的溶劑曲線(曲線均不添加內(nèi)標)，供儀器測定后于Excel軟件擬合曲線方程?；|(zhì)效應(yīng)由基質(zhì)曲線方程和溶劑曲線方程的斜率之比表示。

1.8 方法學(xué)驗證

用純水配制質(zhì)量濃度為2.0～500.0 μg/L的標準曲線，其中含內(nèi)標50 μg/L。在空白的基粉中添加低濃度的混合標準溶液，按優(yōu)化后的前處理方法處理，并于儀器測定結(jié)果。以信噪比S/N=3和S/N=10分別測定方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)。同時，對樣品進行測定，并按照樣品本底值附近的1，2，5倍水平進行加標回收試驗(n=6)，測定所有水溶性維生素的含量，并計算出回收率和相對標準偏差。

1.9 樣品測定

隨機選取20個實驗室的日常樣品，用所建立的方法對多種水溶性維生素進行測定，判斷結(jié)果與明示值之間的偏差。

1.10 數(shù)據(jù)處理

多種水溶性維生素按照1.5方法處理，使用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定不同樣品的峰面積，通過內(nèi)標校正曲線進行定量計算，回收率及相對標準偏差數(shù)據(jù)于Excel 2007軟件中計算分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗前期比較了Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱對多種目標物的峰型及分離度的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BEH C18柱分離度不及T3色譜柱，且C18柱分離硫胺素和核黃素容易峰展寬。因此選擇Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)作為分離柱。同時，考慮到目標物的極性較大，因此選擇了洗脫能力相對較弱的甲醇作為有機相，并且在水相中添加乙酸銨以增大流動相整體的離子強度，從而改善峰型，在此色譜柱及流動相條件下進一步優(yōu)化梯度洗脫程序。最終10種水溶性維生素的MRM色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

由于10種水溶性維生素均含有親核基團，在電噴霧電離源的正離子模式下，可形成穩(wěn)定的[M+H]+母離子，且響應(yīng)較高。雖然部分化合物在負離子模式下也有響應(yīng)，但為了方便測定，最終選擇在正離子模式下測定。將標準溶液以流動注射的方式注入離子源，對準分子離子及其二級子離子進行掃描，每秒采集數(shù)最多的碎片作為定量峰，響應(yīng)次之的作為定性峰。同時，由于不同的化合物，在同一離子化模式下，會具有各自不同的最優(yōu)去簇電壓(DP)，因此需要優(yōu)化以獲得較高的響應(yīng)。另外不同的準分子離子在多反應(yīng)監(jiān)測下，進一步優(yōu)化碰撞電壓(CE)，使最終采集方法的各個二級子離子都達到最佳響應(yīng)。具體的離子參數(shù)見表1。

圖1 10種水溶性維生素的MRM色譜圖Figure 1 MRM chromatograms of ten water-soluble vitamins

2.3 超聲時間對外標回收率的影響

由于方法使用了內(nèi)標物進行校正，所以最終回收率會較高。但為了保證較高的靈敏度，以及避免結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，需要針對外標物的實際回收率進行前處理條件的優(yōu)化。為了避免基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，試驗前期先使用未添加10種維生素的乳粉基粉按1.4的前處理方式進行處理，同時測定本底值，所得基質(zhì)液按照1.3的配制方法用以配制標準工作曲線，不添加內(nèi)標。由于待測定維生素較多，因此，按照目標物的出峰時間，初步確認10種維生素的極性大小，選擇不同極性的4種維生素(吡哆胺、煙酰胺、煙酸和核黃素)進行不同超聲時間下的加標試驗，對回收率進行考察。4種維生素在超聲10 min時，回收率基本達到最大，此后變化不明顯，可能是由于維生素極性均較大，在乳粉中添加后也未與基質(zhì)形成穩(wěn)定的結(jié)合態(tài)，但可能會在基質(zhì)表面形成一定的物理吸附，當提取時間過短時，目標物未能與基質(zhì)解離，并與水相形成氫鍵，所以回收率較低。最終，為了節(jié)省提取的時間，減少試驗成本，選取10 min為最佳超聲時間。詳細結(jié)果見圖2。雖然在不使用內(nèi)標校正的情況下，10種維生素的回收率較高，但只是校正了基質(zhì)效應(yīng)的影響，而未對回收率進行校正，但使用內(nèi)標定量，則可以在不配制基質(zhì)曲線的情況下，同時校正基質(zhì)效應(yīng)和回收率，測定結(jié)果也更為準確。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由于嬰幼兒奶粉中含有較多的蛋白、氨基酸等水溶性雜質(zhì)，在測定過程中，會對目標物的響應(yīng)造成影響。一般可以通過凈化或者色譜分離等手段進行除雜，但由于蛋白、氨基酸等物質(zhì)含量要遠大于目標物，因此一般的凈化方法，基質(zhì)剩余仍較多，而針對試驗的前處理方法，由于維生素作為添加劑加入，為了簡化試驗，選用了直接超聲提取，等電點沉淀蛋白的處理方法。這樣導(dǎo)致了溶液中的雜質(zhì)較多，因此試驗也通過優(yōu)化液相梯度洗脫程序，使目標物與基質(zhì)盡可能分離，從而減少基質(zhì)對目標物響應(yīng)的影響。為進一步考察基質(zhì)效應(yīng)，使用乳粉基粉配制的標準曲線斜率K1與純水配制曲線的斜率K2作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10種維生素的曲線斜率比值ME(Matrix effect)為15.8%～184.0%，抑制和增強效果均超過20%，說明基質(zhì)效應(yīng)明顯，但由于實際定量的標準曲線是含同位素內(nèi)標曲線，可同時對回收率和基質(zhì)效應(yīng)進行校正，因此盡管基質(zhì)效應(yīng)雖然明顯，但對方法整體靈敏度影響不大的情況下，最終使用純水配制的內(nèi)標曲線進行定量。

表1 10種維生素的質(zhì)譜分析參數(shù)?Table 1 MS/MS parameters of ten water-soluble vitamins

圖2 超聲時間對回收率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on recovery (n=6)

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

將標準系列曲線按優(yōu)化后的UPLC-MS/MS條件進行測定。10種維生素均以外標物濃度與內(nèi)標物濃度比值為橫坐標，定量離子峰面積比值為縱坐標繪制校準曲線方程，見表2。10種維生素曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998 7，相關(guān)系數(shù)較高，說明外標物在曲線濃度范圍內(nèi)呈良好的線性。通過對空白基粉的低濃度加標，以信噪比S/N=3和S/N=10分別計算方法檢出限為10～50 μg/kg，方法定量限為30～150 μg/kg，詳細結(jié)果見表2。因為嬰幼兒奶粉中，會額外添加水溶性維生素，而方法的定量限遠低于一般的樣品含量，同時使用內(nèi)標校準的情況下，該標準曲線可準確定量。

2.6 精密度、回收率及重復(fù)性

為了驗證方法的回收率，選擇已添加維生素的陽性嬰幼兒配方奶粉為樣品，日內(nèi)平均測定6次，取平均值為本底值。以本底值的3個不同倍數(shù)水平進行標準添加回收，同一水平的樣品于24 h內(nèi)做6次平行試驗，并根據(jù)回收率結(jié)果計算相對標準偏差。結(jié)果顯示(表3)，平均回收率范圍在85.7%～102.0%，回收率的相對標準偏差值RSDs在1.11%～5.69%。由于受到內(nèi)標物的校正，大大降低了隨機誤差，所以結(jié)果的相對標準偏差值較低。同時，回收率結(jié)果中出現(xiàn)回收率偏差較大的情況，可能是由于樣品中結(jié)合態(tài)維生素的提取存在一定的偏差，從而影響了回收率結(jié)果。綜合考慮，回收率及相對標準偏差數(shù)據(jù)均能滿足一般樣品含量的分析測定要求，因此試驗不對樣品進行酶解處理。

表2 10種維生素的校準曲線參數(shù)、檢出限及定量限Table 2 The parameters of calibration curve and limits of detection and quantitation for ten water-soluble vitamins

表3 10種維生素的方法學(xué)結(jié)果Table 3 Methodological results of ten water-soluble vitamins (n=6)

2.7 方法的實際應(yīng)用

為了驗證方法的實用性，隨機選取20個實驗室的日常嬰幼兒配方奶粉進行測定，測定結(jié)果顯示，20個樣品中，10種維生素的含量均在明示值的85.6%～113.0%，最大偏差約為15%。

3 結(jié)論

試驗對嬰幼兒配方奶粉中的10種水溶性維生素進行直接超聲提取，優(yōu)化了超聲提取時間；調(diào)節(jié)pH至等電點，蛋白質(zhì)沉淀效果良好；優(yōu)化的色譜條件下，10種維生素分離效果好，峰型對稱，且通過與基質(zhì)分離，一定程度上降低了基質(zhì)效應(yīng)；通過流動注射的方式，對10種維生素的各個離子對響應(yīng)進行了優(yōu)化，方法的檢出限和定量限可滿足嬰幼兒奶粉中水溶性維生素的含量測定要求；回收率及其相對標準偏差結(jié)果表明，使用同位素內(nèi)標校正后，方法的這兩項數(shù)據(jù)都能滿足測定要求。